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yangxia12390

银虫 (小有名气)

[交流] 膜蛋白的原核表达

各位大神,我想请教一个关于膜蛋白原核表达的问题,我要做的是一个未知蛋白,预测跨膜区有两个,全长的基因是649个碱基,全长已经连在PET28a上了,但是用BL菌株转化了以后不表达,所以打算做跨膜区的截短试试,看能不能表达,如果做截短该如何做?截了以后会不会表达出来就不是我的原始蛋白了?
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1141998388

木虫 (著名写手)

★
yangxia12390: 金币+1 2014-07-24 10:37:41
小小刘靖

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
要做科研,请先做人。要做人,请先做一个有人品,
2楼2014-07-24 10:36:45
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1141998388

木虫 (著名写手)

哇哈哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
要做科研,请先做人。要做人,请先做一个有人品,
3楼2014-07-24 10:36:57
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pypsak

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
yangxia12390: 金币+3 2014-07-24 20:38:00
表达出来也是包涵体,估计,还是用真核吧,如果对细胞无毒的话
4楼2014-07-24 14:08:53
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yangxia12390

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by pypsak at 2014-07-24 14:08:53
表达出来也是包涵体,估计,还是用真核吧,如果对细胞无毒的话

真核的话又要重新构建质粒了,我怕到后面还是做不出来,而且时间不多了,耽误毕业就不好了,是包涵体也行,只要能表达,你有什么好的建议吗?谢谢了
5楼2014-07-24 20:37:47
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
yangxia12390: 金币+2 2014-07-28 15:54:18
自己做的载体?编码序列有无问题?
如何判断有无表达?染色?还是Western blot?
用IPTG诱导的浓度是多少?在什么温度条件下 ?
蛋白纯化过程大致如何?变性还是没有变性?若无变性是否没有检测包涵体内的蛋白?
信息不够,无法判断。
6楼2014-07-25 09:55:51
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yangxia12390

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-25 09:55:51
自己做的载体?编码序列有无问题?
如何判断有无表达?染色?还是Western blot?
用IPTG诱导的浓度是多少?在什么温度条件下 ?
蛋白纯化过程大致如何?变性还是没有变性?若无变性是否没有检测包涵体内的蛋白? ...

恩,自己做的载体,测过序列,比对是正确的,SDS-PAGE小试来看有木有表达的,没有抗体,用IPTG浓度有从0.1到1mM都试过,37度诱导,在0.5mM的IPTG浓度下做过16度、25度、30度诱导的都没表达,没有进行纯化,因为没看出有明显的条带。
7楼2014-07-28 15:54:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangxia12390 at 2014-07-28 15:54:20
恩,自己做的载体,测过序列,比对是正确的,SDS-PAGE小试来看有木有表达的,没有抗体,用IPTG浓度有从0.1到1mM都试过,37度诱导,在0.5mM的IPTG浓度下做过16度、25度、30度诱导的都没表达,没有进行纯化,因为没看 ...

仅仅是载体序列正确,离正确表达的差异很远,在转录和翻译水平都可能阻止表达,先分离纯化看看有没有表达产物再说
8楼2014-07-29 09:31:57
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yangxia12390

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-29 09:31:57
仅仅是载体序列正确,离正确表达的差异很远,在转录和翻译水平都可能阻止表达,先分离纯化看看有没有表达产物再说...

怎么分离纯化啊?我的蛋白带有His标签,是用Ni柱抓吗?
9楼2014-07-31 16:09:54
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