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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 膜蛋白的原核表达
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yangxia12390

银虫 (小有名气)

[交流] 膜蛋白的原核表达

各位大神，我想请教一个关于膜蛋白原核表达的问题，我要做的是一个未知蛋白，预测跨膜区有两个，全长的基因是649个碱基，全长已经连在PET28a上了，但是用BL菌株转化了以后不表达，所以打算做跨膜区的截短试试，看能不能表达，如果做截短该如何做？截了以后会不会表达出来就不是我的原始蛋白了？
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1楼 2014-07-24 10:35:56
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1141998388

木虫 (著名写手)
★
yangxia12390: 金币+1 2014-07-24 10:37:41
小小刘靖

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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要做科研，请先做人。要做人，请先做一个有人品，
2楼2014-07-24 10:36:45
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1141998388

木虫 (著名写手)
哇哈哈

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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要做科研，请先做人。要做人，请先做一个有人品，
3楼2014-07-24 10:36:57
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pypsak

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yangxia12390: 金币+3 2014-07-24 20:38:00
表达出来也是包涵体，估计，还是用真核吧，如果对细胞无毒的话
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4楼2014-07-24 14:08:53
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yangxia12390

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pypsak at 2014-07-24 14:08:53
表达出来也是包涵体，估计，还是用真核吧，如果对细胞无毒的话

真核的话又要重新构建质粒了，我怕到后面还是做不出来，而且时间不多了，耽误毕业就不好了，是包涵体也行，只要能表达，你有什么好的建议吗？谢谢了
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5楼2014-07-24 20:37:47
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yangxia12390: 金币+2 2014-07-28 15:54:18
自己做的载体？编码序列有无问题？
如何判断有无表达？染色？还是Western blot？
用IPTG诱导的浓度是多少？在什么温度条件下 ？
蛋白纯化过程大致如何？变性还是没有变性？若无变性是否没有检测包涵体内的蛋白？
信息不够，无法判断。
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6楼2014-07-25 09:55:51
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yangxia12390

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-25 09:55:51
自己做的载体？编码序列有无问题？
如何判断有无表达？染色？还是Western blot？
用IPTG诱导的浓度是多少？在什么温度条件下 ？
蛋白纯化过程大致如何？变性还是没有变性？若无变性是否没有检测包涵体内的蛋白？ ...

恩，自己做的载体，测过序列，比对是正确的，SDS-PAGE小试来看有木有表达的，没有抗体，用IPTG浓度有从0.1到1mM都试过，37度诱导，在0.5mM的IPTG浓度下做过16度、25度、30度诱导的都没表达，没有进行纯化，因为没看出有明显的条带。
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7楼2014-07-28 15:54:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangxia12390 at 2014-07-28 15:54:20
恩，自己做的载体，测过序列，比对是正确的，SDS-PAGE小试来看有木有表达的，没有抗体，用IPTG浓度有从0.1到1mM都试过，37度诱导，在0.5mM的IPTG浓度下做过16度、25度、30度诱导的都没表达，没有进行纯化，因为没看 ...

仅仅是载体序列正确，离正确表达的差异很远，在转录和翻译水平都可能阻止表达，先分离纯化看看有没有表达产物再说
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8楼2014-07-29 09:31:57
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yangxia12390

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-29 09:31:57
仅仅是载体序列正确，离正确表达的差异很远，在转录和翻译水平都可能阻止表达，先分离纯化看看有没有表达产物再说...

怎么分离纯化啊？我的蛋白带有His标签，是用Ni柱抓吗？
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9楼2014-07-31 16:09:54
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