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IMichaelhan

木虫 (小有名气)

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[求助] 求大侠帮忙关于引物设计的已有1人参与

下面两个引物是我设计的，我要扩的是5K左右的产物，这种长的产物不好扩增，已经跑了6对引物了，结果不是一片模糊就是特异性不强。对于我一个初学者来说这是最艰难的了，好歹也让我做出来一个再给我出难题吧。图1是我设计的，按照说明一步一步来的，结果hairpin, dimer, false primer, cross dimer这四种情况在结果中都有，图1就是我挑出来的最后的情况了，但是dimer的△G=-4.9，好像△G的绝对值不能超过4.5的，我也不知道那个影响有多大。图2是我把引物长度改变后，又选择的是automatic，然后出来最理想情况，但是师姐们说的一般都选择的是manual，我也不知道automatic和manual的影响有多大，还有引物长度是都选择22加减2的范围吗？
希望大侠能回答的以下一些困扰我已久的问题：
1、hairpin, dimer, false primer, cross dimer如果不可避免怎么办？△G值不能超过多少？
2、设计引物时是选择automatic还是manual，选择不同有什么影响？
3、扩5K、10K产物引物长度设在多少合适？
4、我还能不能做出来？

360截图20140706203938062.jpg

2.jpg

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1楼 2014-07-06 21:06:59

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匿名

木虫 (小有名气)

小志

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2楼2014-07-06 21:57:04

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IMichaelhan

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 安志达天下 at 2014-07-06 21:57:04
你引物设计不正确，既然是扩5K，你的引物扩增产物只是在400bp左右，至于你说的二级结构，引物二聚体，如果与引物的△G相差较大，可以忽略不计，建议重新设计，在片段两端附近重新设计，相当于扩增片段的全长。

你的意思：
1、二级结构不用考虑
2、改变扩增产物大小

扩增产物大小是通过那个PCR product size来修改的吗，系统默认的是100-500，那范围要改成多少呢