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蛋白质SDS电泳跑不出条带，求助各位大仙~已有3人参与
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我做的碱性蛋白酶纯化，酶是从菌株发酵液里提取，首先我的发酵液进行SDS电泳，结果正常，有很清晰的两条带，然后进行柱层析，层析液用透析袋进行PEG20000包埋浓缩，浓缩后测酶活和蛋白含量数据都不错，但是电泳就是什么都没有。开始怀疑是蛋白浓度过高，因此尝试减少上样量，并做了梯度，但是还是都没有！我的marker和别的样品都是有条带的，只有这个没有。 另外，我这个样品和别的样品用的不是一批的透析袋，有没有可能是透析袋不好导致PEG进入液体影响电泳？ 再另外，电泳前样品处理我是100度变性3-5分钟，但是没有离心，会影响电泳效果吗？ 实验一遍遍做不出来非常影响心情……跪求各位大神帮助啊~~~感谢！ |
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 蛋白质生物学实验经验 | 实验技术 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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你的实验现象是不是溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象？我初看时也犯晕，因为好像遇到不多；现在我貌似清醒了一些。 如果是如此，那么原因可能有： 1.缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度，一般不要升高分离胶浓度，要不然会缩小分离被分离的蛋白质的Mr范围。可以分梯度进行，如果这一步无效，那么考虑第二步。PEG进入电泳体系肯定会对电泳有影响，可以在样品液点样前用超滤离心管超滤离心去掉PEG，这步应该再煮沸蛋白质之间，以避免变性后的蛋白质形成不溶物与PEG形成网络聚合体无法去除PEG。如果真的在煮沸蛋白质样品时可能使得PEG形成的串珠状高聚物，那么实际目的蛋白质的分子量可能会加大很多，导致在电泳时在分离胶里更笨走不动，或者位点异常，在应该出现的位点反正是没有。检测在煮沸蛋白质样品时可能使得PEG形成的串珠状高聚物，那么实际目的蛋白质的分子量可能会加大很多的试验方法，可用层析分离出比原来的目的蛋白质大的未知聚合物，收取红外光谱检测出现热变性的目的蛋白质和PEG的特异性的红外光谱的样品，也有可能只有PEG的特异性的红外光谱而没有热变性的目的蛋白质的特异性的红外光谱，因为变性过程中有了PEG的干扰最终变性态也改变了，然后用MS分别：检测热变性的目的蛋白质的特异性的质谱、PEG的特异性的质谱和样品的质谱，前两者与第三者的质谱应该诸多重叠。 2.可能就是在前期处理时损失了目标蛋白质本身。既然你在浓缩后测酶活和蛋白含量数据都不错，可能第二条原因存在的可能性不大。不过如果上样之前和过程中发生了目的蛋白质的特异性水解，那么就是有可能存在的。检测方法是层析分离电泳样品液的目的蛋白质，看看有没有目的蛋白质存在，通过对层析样品的目的蛋白质的生物活性检测加以确定。用到了第二步就不要去做SDS电泳了，除非你非要用WB，那么你就要考虑去掉有关蛋白酶、——考虑碱性蛋白酶的水解酶类在样品组织里是否有充足来源；另外碱性蛋白酶在煮沸变性前是否会发生自溶，比如不同的前期条件也许构成了其自溶反应的条件，比如除去了自溶限制的抑制剂。如果不好除去溶解目的酶的因素，也就不要做WB了，用Pull-down、免疫沉淀、免疫共沉淀、CD等蛋白质-蛋白质相互作用方法代替WB。 我不是大仙，你的问题我是一边录入一边思考，等最后录入完毕时的答案的字数比初始字数多了4倍，而且在网上和书上都抄不到。 个人意见，仅供参考！欢迎继续讨论。 |
2楼2014-07-04 00:25:31
凌波丽
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【答案】应助回帖
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怀疑SDS-PAGE电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带原因和解决方法 凌波丽 2014年7月17日 1. 怀疑SDS-PAGE电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带。分两种情况： （1）对应样品泳道处用很宽的弥散带出现。这又分为两种情况：①上样样品中有不均一的杂质，但是目的蛋白质还是跑出来了，而且目的蛋白质没有发生降解或者凝聚，也没有兼而有之。此时，可检测凝胶中是否有样品，以便确定是涂带、带型扩散还是可以用MADLI-MS、红外光谱仪和紫外可见光光谱仪光谱检测一下可能的凝胶上的目的蛋白质带中会收到的蛋白质样品的MADLI-MS、红外光谱和紫外光-可见光光谱的特征值与目的蛋白质是否有吻合之处，如果完全没有，那么凝胶电泳带中肯定没有需要的蛋白质。此时一般可以检测目的蛋白质的全部特征质谱和光谱峰。而且一般可以在质谱峰中显示范围很宽的质合比峰。②上样样品中有不均一的杂质，但是目的蛋白质还是跑出来了，而且目的蛋白质发生了降解或者凝聚，也兼而有之。此时做第一步检测就没有目的蛋白质的特征质谱和光谱峰了。而且此时可能很难与蛋白质可能没有跑出来相区别，如果非要区别，可能要用上样液处理已经提纯的样品蛋白质，然后用肽谱分析对比。或者用2的方法，再结合目的蛋白质的序列特征，进行MS-MS检测，不过仅仅为了SDS PAGE电泳，没有必要了。 （2）对应样品泳道处有非目的蛋白质特征分子量的其他带出现，而且没有扩散，那么或者目的蛋白质被切断，或者样品中没有目的蛋白质，或者目的蛋白质由于胶的原因走不动，或者目的蛋白质没有充分溶解（需要加入增溶剂），或者变性不彻底以至于目的蛋白质没有在结合SDS之后形成杆状结构而是还有部分球状结构引起电泳位置异常，或者发生了非常均一性的聚合（均一性聚合可能性不大），或者SDS用量不够没有充分使得目的蛋白质没有在结合SDS之后形成均一的杆状结构而是还有部分球状结构引起电泳位置异常（SDS用量不够的话带会较宽或者有多条，一般不会单一而且明亮）。1的原因追究起来很复杂，一般知道一下，直接用2和3检测盒调整就行了。 2.缓冲液和分离胶的浓度不合适，需要重新配胶。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度，一般不要升高分离胶浓度，要不然会缩小分离被分离的蛋白质的Mr范围。可以分梯度进行，如果这一步无效，那么考虑因素2。 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系： 聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd 5 36—200 7.5 24—200 10 14—200 12.5 14—100 15 14—60 浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。 如果样品准备中使用了PEG，那么PEG进入电泳体系肯定会对电泳有影响，可以在样品液点样前用超滤离心管超滤离心去掉PEG，这步应该再煮沸蛋白质之间，以避免变性后的蛋白质形成不溶物与PEG形成网络聚合体无法去除PEG。如果真的在煮沸蛋白质样品时可能使得PEG形成的串珠状高聚物，那么实际目的蛋白质的分子量可能会加大很多，导致在电泳时在分离胶里更笨走不动，或者位点异常，在应该出现的位点反正是没有。检测在煮沸蛋白质样品时可能使得PEG形成的串珠状高聚物，那么实际目的蛋白质的分子量可能会加大很多的试验方法，可用层析分离出比原来的目的蛋白质大的未知聚合物，收取红外光谱检测出现热变性的目的蛋白质和PEG的特异性的红外光谱的样品，也有可能只有PEG的特异性的红外光谱而没有热变性的目的蛋白质的特异性的红外光谱，因为变性过程中有了PEG的干扰最终变性态也改变了，然后用MS分别：检测热变性的目的蛋白质的特异性的质谱、PEG的特异性的质谱和样品的质谱，前两者与第三者的质谱应该诸多重叠。 3.样品处理不合适，可能就是在前期处理时损失了目标蛋白质本身。既然你在浓缩后测酶活和蛋白含量数据都不错，可能第二条原因存在的可能性不大。不过如果上样之前和过程中发生了目的蛋白质的特异性水解，那么就是有可能存在的。检测方法是层析分离电泳样品液的目的蛋白质，看看有没有目的蛋白质存在，通过对层析样品的目的蛋白质的生物活性检测加以确定。 到了此刻就不要去做SDS电泳了，除非你非要用WB，那么你就要考虑去掉有关蛋白酶、——考虑碱性蛋白酶的水解酶类在样品组织里是否有充足来源；另外碱性蛋白酶在煮沸变性前是否会发生自溶，比如不同的前期条件也许构成了其自溶反应的条件，比如除去了自溶限制的抑制剂。如果不好除去溶解目的酶的因素，也就不要做WB 、Pull-down、免疫沉淀、免疫共沉淀等，可以用MADLI-MS、圆二色光谱、红外光谱和紫外光-可见光光谱等更易于操作蛋白质-蛋白质相互作用方法代替WB 、Pull-down、免疫沉淀、免疫共沉淀等，但是要有被检测的非共价的复合物的MADLI-MS、圆二色光谱、红外光谱和紫外光-可见光光谱等特征值。 |
5楼2014-07-17 12:01:33
凌波丽
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6楼2014-07-17 12:17:16
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4.带型弥散，上样前充分离心，即可检测出是否目的蛋白质是否完整。如果姆的蛋白质完整也可以保证得到清晰的准确的木的蛋白质条带。上样前充分离心，取上清液，然后再用超滤，去除一些小分子，再用表面活性剂拆解开聚合体，最后超滤，即去除表面活性剂又去除一些小的碎裂片段和其他小分子，可以让带型好看些。 5.如果需要了解带型弥散的电泳带是不是发生了样品蛋白质的降解或/和聚合，聚合体不一定是整体的完整的蛋白质之间聚合，也可能是蛋白质-降解碎片、降解碎片-降解碎片之间发生了聚合。试验检测此部分工作比较复杂，但是不是非常困难，今天我刚想到的。（1）确定涂带的胶条中的样品在非目的蛋白质的本应出现的位点处的胶块里至少含有蛋白质。如果根本不是蛋白质，那么肯定就不是带型弥散的电泳带肯定不是目的蛋白质或降解或聚合引起的。检测不难，只要对于弥散带的胶按照回收蛋白质的标准回收之，然后用光度计检测是否有肽键的特征峰即可，还可以用酸水解后测定有无氨基酸的特征吸收峰。有就往做，没有到此打住。能够考马斯亮蓝染色不能作为极强有力的蛋白质存在的证据。（2)检测涂带的片段是不是目的蛋白质的降解片段可以在发生涂带的凝胶上大致等距离切割下不同的细条凝胶，然后回各个收凝胶的样品，透析、超滤后再次进行SDS PAGE电泳，这样看看带型如何，把其中比较中的带的凝胶挖下回收用基于Edman降解法的自动测序仪测定其序列，也可以用MS-MS，但是要用蛋白水解酶先做凝胶内降解然后才能上质谱仪，测定序列。多取涂带的电泳带中的几处分子量小于目的蛋白质所在位置的胶块进行上述工作。然后将不同位置的胶块的序列加以拼接，可能能够获得小于目的蛋白质的涂带部分的蛋白质的确是目的蛋白质的降解片段。此部分包括降解碎片-降解碎片之间发生聚合的情况。（3）检测蛋白质-蛋白质聚合或者降解碎片-蛋白质聚合，既然聚合是非共价的，那么上样前加入表面活性剂，大于于目的蛋白质所在位置的弥散带应该较少；另外取一些大于于目的蛋白质所在位置的弥散带的胶块，回收蛋白质，之后加入表面活性剂拆解多聚体为单体，然后用HPLC或者MS，应该能够获得至少部分的目的蛋白质的Mr对应的洗脱峰和质荷比峰。 |
7楼2014-07-17 22:34:15
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youlinglyw: 金币+5, BioEPI+1 2014-07-23 09:25:25
youlinglyw: 金币+5, BioEPI+1 2014-07-23 09:25:25
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SDS-PAGE电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带原因和解决方法（没有弥散带出现、简版） 凌波丽 2014年7月23日 1.分离胶的浓度不合适，需要重新配胶。处理办法：降低分离胶的浓度，一般不要升高分离胶浓度，要不然会缩小分离被分离的蛋白质的Mr范围。可以分梯度进行，如果这一步无效，那么考虑因素2和3。 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系： 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%T） 蛋白质分离范围/kd 5 36—200 6 30—200 8 20—175 10 15—150 12 10—100 15 6—50 浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。可能是蛋白质相对分子量超出了分离胶分离的范围而无法或者很难通过分离胶，或者说目的蛋白质在分离胶里走不动了。 2.改变分离胶和电泳缓冲溶液的pH，分离胶的pH一般可以为8.8-9.2。 3.样品可能上样量太少了，使得考马斯亮蓝无法有效染色。每个加样孔的最低蛋白质的质量是：0.1μg（考马斯亮蓝染色），2ng（银染）。但是每一个点样孔的蛋白质的加样量不要一般大于20μg，最多不能超过40μg. 4.样品未能充分溶解。可以适当加大样品缓冲溶液的浓度，比如使用（2-5）X样品缓冲溶液。 2X样品缓冲溶液制备： 2X sample buffer solution: combine 5ml Stacking gel buffer solution (Stacking gel buffer solution: dissolve 15.2 g Tris base in 200 ml water, adjust to pH 6.8 by slow addition of concentrated HCl, add water to 250 ml final volume),8ml 10% SDS solution ,and 1ml water. Add 4ml glycerol,2 ml 2-mercaptoethanol and mix well (preferably in fume-hood). Add a small amount(1-2 mg) of bromphenol blue indicator dye. Divide the sample buffer 1ml portions(plastic screw cap vials are preferable) and store at -70℃(or -20℃ for short periods).Note: the solution may require warming to dissolve crystallized SDS. ——from: Creighton-Protein Structure------A practical approach, LCL Press,1997,8,10. 一般使用时需要把2X sample buffer solution稀释一倍之后使用，如果真的要用5X sample buffer solution，建议溴酚蓝指示剂染料（bromphenol blue indicator dye）适当减少一些。 国内有蛋白质实验指导书一开始就直接用5X样品缓冲溶液加入样品蛋白质，然后沸水浴，这样可能影响实验结果，因为高浓度的SDS会干扰考马斯亮蓝染色，过多溴酚蓝指示剂染料（bromphenol blue indicator dye）也可能引起蛋白质的电泳的条带异常。如果样品缓冲溶液浓度较大，建议染色时加入戊二醛使得考马斯亮蓝染色效率会大大提高。 如果使用样品缓冲溶液可能会出现不溶性颗粒，宜用电磁搅拌子温和搅拌使其充分溶解，然后再进行沸水浴变性。用电磁搅拌子温和搅拌使其充分溶解无效，可以在沸水浴变性5-10分钟再看，还是不溶解，那就过滤去除。 5.沸水浴变性5-10分钟之后的蛋白质样品，在上样前还要离心操作，并且去除掉不溶性颗粒。 6.在考马斯亮蓝染色时，可以考虑加入戊二醛使得考马斯亮蓝染色效率会大大提高。 使用步骤是，在染色时将凝胶移入50%的甲醛和10%醋酸缓冲溶液混合的容器内，瀙泡至少1h，期间换液2-3次；而后在通风柜中用10%的戊二醛瀙泡或冲洗0.5 h，其实就是轻轻震荡一下，让戊二醛充分穿透凝胶使得蛋白质分子之间发生交联，然后用蒸馏水连续清洗2h，如此处理，考马斯亮蓝染色效率会大大提高。 7.融合蛋白质表达时可能是由于含有的目的蛋白质融合蛋白质的氨基酸序列变大，而且蛋白质在细胞里是边翻译边折叠，可能引起了一些异常的折叠，尤其是在大肠杆菌细胞里，外源蛋白质如果表达多而快，往往还会形成不溶解的包涵体，即使不形成包涵体而形成分泌蛋白质，融合蛋白质的折叠结构往往也与天然游离的蛋白质不同。所以在样品上样前的煮沸阶段和SDS变性和溶解都不同，一般1克蛋白质结合1.4克SDS，操作时SDS用量可以稍大些。 更正：以下引号内的内容适用于非变性的凝胶电泳，不适于SDS PAGE 电泳。因为在SDS PAGE 电泳中上扬蛋白质是变性状态而且结合了SDS，这样电泳带的位置只与蛋白质的相对分子量有关，与静电荷无关。特此更正！ “2.缓冲溶液可能不合适。不适当的电泳缓冲溶液影响了目的蛋白质的电荷量，没有电荷或者带着往反方向的电荷的话，溴酚蓝到了凝胶底，蛋白质也移动不出来。预测蛋白质的等电点和滴定曲线，可用DNAstar，启动DNAstar中的Protean，打开或者建立一个序列文件，选择Analysis-Titration Curve，会显示出纵坐标为pH值，横坐标为净电荷的坐标图，并且会显示净电荷为0的精确位置，对应的纵坐标就是pI值。配制和使用电泳缓冲溶液时参考DNAstar模拟计算出目的蛋白质的pI值对实验是有价值的。有人如果不怕累、不怕烦，或者就是想要修行一下，那么也可以先对目的蛋白质用等电聚焦测定出pI值。另外缓冲溶液的离子强度也要考虑。可以多准备几种pH值与目的蛋白质的pI值有差异的离子强度梯度分布的缓冲溶液，轮番替换一下，选择最有效的那一种缓冲溶液。” 最近总是晕晕的，老是答错问题或者答得文不对题。 |
8楼2014-07-23 00:39:29
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