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zhumeidong

木虫 (小有名气)

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[求助] 请问细胞膜蛋白怎么提取，目的蛋白分子量170kD 已有3人参与

请问细胞膜蛋白怎么提取，目的蛋白分子量170kD，实验室有Roche的complete EDTA-free蛋白酶抑制剂04 693 132 001能用上吗？

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1楼 2014-05-29 21:25:39

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飞约疯人院

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科学怪人

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【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-29 22:19:52

普通的Triton-x114就可以了把，下面有一个很简单的protocol
NRC Institute for Biological Sciences
Triton X-114 extraction protocol (Hydrophobic protein preparation)

Ressuspend cells in Solution A (dil 1/8) and add 15 μl of mammalian cocktail proteases inhibitor (Sigma).
Add 1 third of the volume of solution B
Incubate on ice for 1 hour with frequent vortexing.
Centrifuge at 10 000g for 10 minutes at 4°C to pellet unbroken cells and nuclei.
Transfer supernatant in clean eppendorfs then incubate at 30°C for 3 minutes (until sln is cloudy).
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Transfer Aqueous phase in new eppendorf (but keep detergent phase at room temperature).
Add X volume of triton X-114 to Aqueous phase:

Vol of Aq phase = X vol of triton X-114
24.6
Shake well then incubate 3 minutes at 30°C (until cloudy) then transfer on top of detergent phase slowly.
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Remove Aqueous phase with pipette down to detergent interphase.
Precipitate hydrophobic protein (detergent phase) with 10X volume of acetone. Place overnight at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Ressuspend proteins in IEF sln (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT) then precipitate protein again with 10 volume of acetone. Place 5-10 min at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Air dry pellet then dissolve protein in IEF solution
Solution:

Solution A: 80 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 1,2M NaCl

0,63 g Tris-HCl
3,51 g NaCl
Dissolve in 30 ml of water
Adjust pH to 7.4
Adjust volume to 50 ml with water
Solution B: 40 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 600 mM NaCl ; 4% triton X-114

5 ml of sln A
Add triton to have a final concentration off 4%

4% x 10 ml = ml
[triton X114]
Adjust volume to 10 ml with water
只有英文的，没中文的。

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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。

2楼2014-05-29 21:43:00

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zhumeidong

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2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-29 21:43:00
普通的Triton-x114就可以了把，下面有一个很简单的protocol
NRC Institute for Biological Sciences
Triton X-114 extraction protocol (Hydrophobic protein preparation)

Ressuspend cells in Solution A (d ...

用Triton X-100可以吗，而且这个方法可以只把膜蛋白提取出来吗

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坚持从一点一滴开始！

3楼2014-05-29 22:18:57

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