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faith_hao

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[交流] 关于western相关试剂材料的选择（转）已有7人参与

1、样品的制备：仍然是选择RIPA裂解液和PMSF作为黄金搭档，经费充足的实验室考虑特异性的蛋白酶抑制剂cocktail，磷酸酶抑制剂就不需要特别添加了，因为RIPA裂解液里面一般都含有NaF，我觉得应该足够了。因为碧云天里面的蛋白裂解液比较便宜，很多客户会选择这个公司的产品，在这当中有些客户唯恐提的蛋白有大的损失，喜欢用强的RIPA裂解液，觉得裂解的越彻底越好，结果得到的裂解产物里面有很多胶冻样的粘稠物，这些东西可能是细胞核里面DNA，有时候离心都难离下来，特别是提细胞全蛋白的时候，在此希望客户按部就班的选择合适的裂解液，不是越强越好。如果检测的目的蛋白不是部分或者全部位于细胞核内，我一般不建议用这种强的RIPA裂解液。另外，检测特异部位蛋白的表达情况，比如线粒体，细胞核，细胞膜等部位，要根据实际情况选择合适的提取试剂盒，我看国内有好多公司都会提供相应的试剂盒，上海生工，南京凯基，碧云天都有，和国外pierce这些厂家的提取试剂盒相比，效果怎么样，我没有比较过，就不发表评论。顺便提一下，这样部位内参的选择，经费充足的实验室，可以选择特异的内参，比如组蛋白作为核蛋白内参，离子通道蛋白作为膜内参。当然，用胞浆蛋白GAPDH或者beta-actin，作为内参，我个人觉得也没有大问题，解释呢是提取的蛋白过程中会有固定比例的胞浆蛋白的污染。另外，选择进口膜蛋白提取试剂盒，一定要慎重，仔细看一下说明书再确定是否购买，现在国外膜蛋白提取试剂盒得到大家公认的是sigma，merck和piece公司，但是前面两个对离心的条件非常苛刻，大部分实验室达不到这个条件，而pierce的要求则不那么苛刻。
2、蛋白的定量：这一步也是非常重要的，作为后面加样，确定每孔加样体积的参考依据很重要。很多教科书都写一孔加30-100ug就可以了。每孔也不是加的蛋白量越大越好。蛋白定量试剂盒，用国产的就可以了，上海生工，碧云天，上海博彩的都还不错。
3、蛋白上样缓冲液：不管是2*的还是5*的，不管是自己配的还是从公司购买的，都差不多，因为配方上没有什么大的差别，足量的溴酚蓝，还原剂beta-巯基乙醇，带动蛋白下沉的甘油等等。这里有个问题，客户经常问我，我也不知道答案。提好的蛋白定完量后，和上样缓冲液一起煮过再保存，是不是更好？
4、SDS-PAGE配胶系列：sigma和bio-rad，都有，东西很好，但是我这边的客户很少会选择这两个厂家，因为价格太贵，而且分装的配胶相关的试剂或者碧云天的配胶试剂盒，做出来的蛋白电泳图片，也是非常漂亮的，No problem。甘氨酸、tris-碱，SDS这些对试剂的级别要求不是很高，选择分装的，ok。
5、蛋白marker：对于，western blot检测来说，一般会选择彩虹蛋白marker或者发光marker，这两种marker各有优势。彩虹蛋白marker，可以帮助判断电泳时间是否到位，转膜是否成功以及准确的裁膜，这对一次电泳同时检测几个指标非常重要。在这里不得不提到Fermentas的经典之作，SM0671，10-170kd，觉得非常经典，指示的非常清楚，这个品牌旗下其他货号的彩虹marker和它比，都很逊色。发光蛋白marker则可以准确的在胶片上显示目的条带的大概分子量，在发表的文章上面显示出来，个人感觉增色不少。在蛋白marker的选择上，存在着一个误区，好多客户总是非常挑剔的去选择具有和自己检测的目的蛋白最相近的条带的marker，其实在western bolt检测中，我觉得一点必要没有。western blot检测过程中抗体结合的特异性决定了检测的特异性，以及抗体说明书里面的对目的条带位置的描述用到的“approximately”这个字眼，就绝对marker只起到大体的参考作用就可以了。
6、转膜过程中滤纸和膜的选择：滤纸就选择whatman 的3M滤纸。膜到底选择Nc膜还是PVDF膜，就和选择萝卜还是白菜一样，看个人的喜好了，虽然资料里面写的是PVDF膜对蛋白具有更强的结合力。对于小分子的蛋白的检测，推荐选择0.22um 孔径的膜，另外及时调整转膜电压和时间，防止蛋白穿透。
7、封闭：脱脂奶粉（国产的光明牌据说还不错）还是粗制的BSA，都可以。如果后面检测发现背景很深，其他抗体浓度等条件也调整过后，还是不见效的的情况下，就可以选择另外一种封闭条件试试看。
8、一抗：western blot检测中最烧钱的一抗闪亮登场了，这个话题永远都是讨论的最多的。下面这几个厂家的抗体还是我比较喜欢并乐意推荐给客户的，CST，Millipore旗下的chemicon产品，RnD，Abcam，Sigma，epitomics，santa cruz的都还可以。这里简单的提到两个公司的产品，CST和santa cruz，其余的有空再长长的写一篇。CST抗体，质量好，性价比高，信号通路方面比较全，而且抗体效价比较稳定，一般1：1000稀释去做，不需要怎么去摸条件，缺点是抗体的种类大部分集中在信号通路方面，相对来说品种少了，另外一个不得不说的就是CST抗体的投诉率虽然比较低，但是投诉成功率也不高，这样让我们中间的试剂商很难做，听说吉泰从去年因为这个原因退出了对CST的代理。Santa cruz的抗体，的确投诉率很高，现在在客户当中的口碑也不怎么好，那些因为从其他几个大公司买不到自己所需的抗体的客户，不得不选择santa cruz抗体做实验的客户，往往带着有色眼镜去对待它，很多时候不愿意花多的精力去优化条件。但是santa的抗体，也有优点，品种全，售后服务好，权威文献里面应用的也很多，投诉成功率还是比较高的，呵呵。内参抗体的选择，有钱的客户可以选择进口的大品牌，经费紧张的选择杭州贤至，杭州华安的也不错。上面废话太多了，下面简单点。
9、抗体稀释液：碧云天的就可以，实用。
10、HRP标记的二抗：国产的足够。不放心的话，可以用国内试剂商分装的jackson二抗，真的还不错，效价高，价格低。
11、ECL：推荐pierce的货号34079，34080。Thermo pierce前两年，推出来的专门针对中国客户的super ECl，价格的确便宜了很多，但是和pierce原装的比，真的不是一个档次，表现为淬灭的非常快。不客气的说，比较坑人。12、胶片：柯达和富士的都可以。
13、显影定影粉：天津产的就可以。

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