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joyjane88铜虫 (初入文坛)
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[求助]
有关EMSA（凝胶阻滞）的，是否有aEMSA（高浓度琼脂糖凝胶阻滞）这种技术？
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| 最近老板要求做EMSA，实验室没有任何经验。听着同位素和DIG又贵有麻烦，同位素还危险。从一篇中文文献（Sample Text喜盐芽孢杆菌甘氨酸甜菜碱合成基因的克隆与功能分析）上看到有人直接用1.5%琼脂糖凝胶做凝胶阻滞，DNA探针不用标记，跑完胶直接扫胶，似乎做得也想那么回事。但查一下网上的EMSA几乎没有用这种简单的方法的。有谁能对这个方法给个解释？最关注这么做是否可行，其次想知道如果可行是否和标记探针的EMSA实验在细节上有什么差别。任何经验的回复都不胜感激！！！Sample TextSample TextSample Text |
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【答案】应助回帖
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adslye(金币+2): 鼓励交流~不过如果精简，处理下帖子内容就好了~ 2011-10-08 19:30:33
joyjane88(金币+1): 答非所问 2011-10-12 13:20:38
adslye(金币+2): 鼓励交流~不过如果精简，处理下帖子内容就好了~ 2011-10-08 19:30:33
joyjane88(金币+1): 答非所问 2011-10-12 13:20:38
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凝胶阻滞（迁移） 实验名称 实验内容 客户提供材料 服务期限 提交结果 服务报价 凝胶阻滞（迁移）实验 EMSA KGSP010 核蛋白提取 细胞或组织样本 3天 核蛋白定量结果 120元/样本 预实验 指标信息、一抗等 2周 800元/蛋白 正式实验 一抗 2-8周 （视样本数定） ECL显色结果 1000元/膜，最多可做八个样品 实验目的：检测待测样品中特定目的核蛋白的转录调控活性。 实验原理：蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，在琼脂糖胶或非变性胶中电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，进行未知蛋白的鉴定。 实验材料： 试剂：核蛋白提取试剂盒、bradford法蛋白含量测定试剂盒、生物素标记 3’端 DNA试剂盒、Lightshift EMSA Optimization & Control Kit、化学发光法核酸检测试剂盒。 仪器：恒温培养箱、蛋白电泳仪、低温冰箱。恒温水浴箱、紫外交联灯、振荡器、脱色摇床。 实验内容与方法： 1、 核蛋白样本提取与蛋白定量。 2、 生物素标记DNA3’端并去吹TdT。 3、 Super-Shift反应，配制6.5%聚丙烯酰胺凝胶，配制好各反应体系，EMSA室温结合反应20min，电泳上样。 4、 电转膜，操作方法同常规Western blot转膜操作。 5、 紫外交联，将核酸交联于PVDF膜上。 6、 化学发光法检测生物素标记的探针。 客户提供实验信息： 1、 实验信息 样本来源： 细胞 种属来源__________ or 组织 组织来源_________ 样本数量：__________ 检测蛋白信息：目的蛋白名称_______________ 蛋白分子量_________ 2、实验材料 （1）样本材料 新鲜或冷冻细胞不少于106个，新鲜或冷冻组织样本不少于50 mg。 已提取的蛋白样品蛋白含量不低于0.1ug/ul。 （2）试剂：蛋白提取与定量可根据客户要求选用特定试剂盒，如客户不提供 试剂盒且无特别要求，则选用凯基公司相应试剂盒产品。Super-shift反应所用试剂盒同上，凯基也可以提供试剂盒代订服务。 服务周期：（2到8周，根据样本数量而定） 结果提交：提交实验报告书（包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析）、原始数据、图片，文本或电子版。 收费标准与付费方式： 核蛋白提取 （核蛋白提取及蛋白定量结果，100元/样） 预实验 （客户提供一抗，800元/膜） 正式实验 （客户提供一抗。1000元/膜，每张膜最多8个样） 实验范例： 细胞中AP-1蛋白转录活性实验 灰度分析 样品编号 阳性面积 阳性平均灰度 背景灰度 净灰度 阳性灰度积 空白 1450 176 176 0 0 1 3177 209 175 34 108018 2 6553 211 175 36 235908 3 4995 199 174 25 124875 4 5618 211 174 37 207866 5 1936 182 173 9 17424 6 4752 197 172 25 118800 7 4547 202 171 31 140957 8 4967 196 171 25 124175 9 1854 175 170 5 9270 10 5210 187 170 17 88570 11 6360 200 170 30 190800 12 4863 198 170 28 136164 阳性对照 7519 201 170 31 233089 竞争 4057 197 171 26 105482 |
4楼2011-10-08 09:10:12
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