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SIQING2013

新虫 (初入文坛)

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[求助] DNA提取总是降解，核酸定量OD比值异常，帮忙分析一下电泳图已有3人参与

提取线虫DNA，新鲜组织，用液氮研磨成粉状，然后用称量勺转移至离心管，然后加入缓冲液DS200ul，混匀，然后加蛋白酶K20ul，55度，2h,然后加裂解液MS 220ul，65度，10min，然后加无水乙醇220ul，转移至纯化膜，离心，弃废液；然后用蛋白漂洗夜PS，漂洗，再用漂洗液PE漂洗两次，再加入50-80ulTE洗脱。用的是东盛基因组提取试剂盒。电泳图如下
三哥泳道都点了10ul，样品1第一泳道核酸定量结果如下：浓度23.6ng/ul，A260/280:1.68，A260/230: -0.76,A230:-0.620;
样品2第二泳道核酸定量结果如下：浓度56.5ng/ul，A260/280：1.8，A260/230：-9.98，A230：-0.113.
MARKER用的是takara的15000 ladder,取10ul，每条带越100ng，
另外，对样品1和2用Picogreen试剂盒定量结果显示，样品1的浓度为47.67ng/ul, 样品2的浓度为：73.68ng/ul。注：Picogreen试剂盒为对双链DNA具有特异性结合的荧光染料定量，可避免RNA,SSDNA的干扰，定量同时做的标准曲线R2为0.997.
问题：1：从电泳上看，DNA存在降解。我最近连续提了三个星期了，整个过程也避免漩涡震荡，基本用手颠倒混匀，还是没办法解决，求高手指点。
2：DNA定量感觉都不准。举一个例子，从条带亮度来看，样品一的亮度不如MARKER亮，但是后面OD值和荧光定量结果都远高于100ng,也就是应该高于marker的100ng. 不知道荧光定量结果可不可信。我最终要根据荧光定量的结果来进行下一步实验，很纠结。
3: 样品1是被我稀释了差不多三倍的结果，之前的亮度跟样品2相似。在经过两天4度的放置以及稀释后，拖带看起来变得没有那么明显。在刚刚提出来放置2h后跑过一次电泳，拖带比这个严重。这个应该怎么解释:
实验做了快七八九个月了，一点进展都没有，非常烦恼，跪求各位大侠指点迷津，，，，

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1楼 2014-05-27 16:17:07

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-05-27 16:33:54
1.建议楼主在提取的DNA中加入RNA酶，然后在测浓度，RNA会干扰DNA浓度，即使是试剂盒也不行的
2.试验中的所有离心管和PCR管，研钵都要经过高温高压灭菌处理

3.试剂盒也有他的缺点，建议用最普通且实用的CTAB法提 ...

谢谢你的建议。不过我的实验方法是参考文献的，文献不建议用酚氯仿抽提。

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3楼2014-05-27 17:25:15

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飞约疯人院

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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 18:51:05

1.建议楼主在提取的DNA中加入RNA酶，然后在测浓度，RNA会干扰DNA浓度，即使是试剂盒也不行的
2.试验中的所有离心管和PCR管，研钵都要经过高温高压灭菌处理

3.试剂盒也有他的缺点，建议用最普通且实用的CTAB法提取，方法如下：
（1）取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中；
（2）加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min；
（3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。
（5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止；
（6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min；
（7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
（8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。

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