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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » Elisa检测样本中蛋白的含量，标曲线性范围和样本最佳稀释倍数怎么确定？
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蒲睛琉弈

新虫 (初入文坛)

[求助] Elisa检测样本中蛋白的含量，标曲线性范围和样本最佳稀释倍数怎么确定？已有2人参与

采用别人推荐的国外的Elisa试剂盒，本来是定性的试剂盒，只有阳性对照品，阳性对照倍比稀释后线性很好，我们就考虑用来做定量检测。该试剂盒用的是双抗体夹心法。现在遇到了以下两个问题，想请各位帮忙支支招。
1.关于标准曲线范围：阳性对照品的单位为ng/mL单位，本来含量就很少，倍比稀释了好多浓度，标曲用线性拟合，线性依然非常好，R2=0.999以上，那么我要怎么确定这个试剂盒的检测下限或定量下限（因为我的样本中本来含量可能就很微量，低浓度的检测比较有用）
2.关于样本的最佳稀释倍数：我要检测的是一种外源蛋白，不是抗体类蛋白。这种蛋白从理论上是几乎不太可能在血清中存在，但我要Elisa检测确定下这种蛋白是否进入血清。由于没有阳性血清，目前测得的血清中含量都很微量，但由于还没摸索出最佳稀释倍数，请教各位有什么好方法可以确定其最佳稀释倍数。听老师说以血清为基质加入含这种蛋白的溶液进行稀释，我还是不太懂该怎么操作，亲们有经验的多指教指教啊。那么其他样本的最佳稀释倍数又是怎么确定的呢？
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1楼2014-05-22 11:50:18
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shuishuisky

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对倍稀释啊，确定一个大致范围在细化去分析
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2楼2014-05-23 00:27:22
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寂静之林

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
youlinglyw: 金币+5, BioEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-06-07 09:10:58
我来尝试回答一下楼主的问题。
第一个问题，标准曲线的范围。对于标准曲线的最低检出量，其实有至少两种方法可以确定的。第一，理论上的最低检出量，这个可以通过计算来确定，这是夹心法，将阴性对照的OD值+2SD（阴性对照OD值的标准差），计算出来的OD值代入拟合出来的标准曲线，就是理论上的最低检出限；第二，将阳性对照用阴性对照进行对倍稀释，稀释N次之后，每个稀释度做10个复孔，计算每个稀释度10个复孔OD值的精密性（CV%值），如果再第N次稀释的CV%大于15%，则第N-1次稀释时的浓度，就是最低检出限。其他的方法，我也不太清楚了，但如果是作为标准曲线的第二个点的浓度（即零浓度之后的第一个浓度点），建议可能的话，就用cutoff值（临界值）作为其浓度。
第二个问题，血样的最佳稀释度。这个要根据血样里，待测物质的浓度来决定，如果待测物质的浓度在标准曲线的浓度范围里的话，血样不用稀释都可以，如果待测物质的浓度超出了标准曲线的线性范围，则把血样稀释至线性范围内就行了。
补充一下，以血清为基质，把待测物质按一定的浓度加入到血清里，进行检测。我觉得这是测定试剂的回收率，是判断试剂准确度的标准之一，是定量试剂准确性评价的一种重要方法。
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3楼2014-06-06 21:05:08
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