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ptccc

铜虫 (初入文坛)

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专业: 蛋白质组学

[求助] 测酶活的蛋白怎么保存已有2人参与

各位亲，之前一直做基因克隆啊神马的，从没了解过测酶活什么的。我有一大批样品要测酶活，一次提蛋白是不可能的。我能不能从组织里提好蛋白放回-80保存，全部提完拿出来测酶活？还是提好了马上就要测酶活？放-80要怎么保存？毕竟我觉得保存组织和蛋白肯定不一样的吧？有做过的跟我说一下好吗？谢谢
顺便问一下，蛋白浓度能不能用微量测定仪测定啊？考马斯亮蓝法很麻烦啊。但是微量测定仪测的发文章准不准啊

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1楼2014-05-20 23:20:38

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
ptccc(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-29 20:36:00
ptccc: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-05-31 10:12:39

转载：
一般一瓶动物细胞长满后用胰酶消化，消化完以后用D-Hinks吹打下来，4℃，1000转，6~10min 离心。倒掉上清，再用D-Hinks重新分散，4℃，1000转，6~10min 离心，倒掉上清（如果暂时不要测酶活的话，直接将离心后的沉淀冻于-80℃，可保存2~3个月，用时直接加生理盐水进行后处理即可）。再用生理盐水重新分散，枪头打匀，超声波破碎，一般一瓶动物细胞加1mL生理盐水，一般用总工作时间300S,，开5S，停10S，槽温度稍设高点，一般50℃（此温度与你EP管内的温度无关，但是温度探针伸到反应体系中的温度就得设低些），20%功率。破碎完后4℃，12000转，5min 离心（看底部的沉淀多少，破碎完全的沉淀应该是很少的，如果还很多，重新打散后加时间再破碎）。将上清取出摇匀后检测蛋白浓度，我用的是考马斯亮蓝+BSA法。然后蛋白用于即时检测，暂时不用的话立刻冻在-80℃，可保存2~3天，但破碎后的蛋白最好当天检测，不然活性会受到影响。