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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎样确定一个已知基因两侧的未知序列
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)

[求助] 怎样确定一个已知基因两侧的未知序列 已有5人参与

我通过southern blot 的方法做了一下，发现检测量达不到10μg，根本检测不出来，阳性条带倒是出来了，然后我问了一下我们的老师，他说让我试一下单引物扩增，然后我在这个已知基因的下游设计了一个引物，PCR往下游扩增，送去测序，老是测不出来，怎么办，愁死了，我就是想鉴定一下，我研究的这个耐药基因是在质粒还是在染色体上，PS，单纯的用提质粒，基因组的方法扩增目的耐药基因，我们老师说不能很肯定地说明该基因是在染色体还是在质粒上，因为我要做缺失，来证明这个耐药基因的作用，所以这一点就非常重要，求大神指导，感激不尽。
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1楼 2014-05-17 20:25:24
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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预防凯凯(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-19 10:00:30
tail-PCR或者反向PCR。一般我喜欢反向。

如果你只是想知道它在质粒上还是染色体上，southern blot不就ok了？量不够，不能多提取些吗？提取1 L菌液如何？
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2楼2014-05-17 22:03:32
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-22 13:10:37
有些公司有这方面的试剂盒，我记得以前做的时候用的一个试剂盒叫genewalking
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3楼2014-05-17 22:19:00
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-22 13:10:16
用染色体步移的方法可以扩侧翼序列。
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4楼2014-05-18 08:55:45
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-22 13:10:22
染色体步移技术，或者做5`RACE和3`RACE，都可以
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5楼2014-05-18 09:53:16
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石鸣涧

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-22 13:10:27
Pcr出来测序测不几出来意思就是可以扩增出来，那你可以先连个TA克隆，送质粒测序，成功率会高很多的．
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6楼2014-05-19 09:47:03
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-05-18 08:55:45
用染色体步移的方法可以扩侧翼序列。

能在具体点吗，我是新手，不是很懂
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7楼2014-05-22 18:52:04
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 预防凯凯 at 2014-05-22 18:52:04
能在具体点吗，我是新手，不是很懂...

你去搜一下染色体步移技术，里面包括很多种方法，包括ipcr,TAIL PCR等，都比较好用。我只做过TAIL PCR，参考的刘耀光的文章。另外也可以用5‘Race,3'race这些都是有试剂盒的。
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8楼2014-05-22 19:50:43
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