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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

[求助] 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢已有4人参与

应用CloneTech Smart RACE试剂盒做3’RACE 应用试剂盒的UPM引物基因特异性引物 退火58度 延伸2min

得到了750bp 和300bp 的条带 测序 结果都是26S核糖体RNA基因 ，不是我要的基因序列

请问我到底哪里出了错？
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1楼2014-04-23 15:48:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

karin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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yoyo单眼皮: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-04-24 21:30:25
yoyo单眼皮: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-05 16:07:17
我最近也在用CloneTech Smart RACE试剂盒做5’RACE ，换了若干引物，用的touch-down PCR，测了若干2kb、1kb、750bp、500bp条带，都是核糖体28s，18s，5.8s基因簇里的片段。后来我拿自己的基因和这个基因簇对比了一下，确实有相似度高的部分，后来就选择相似度低的部分设计特异引物，目前正在做，反正不再出以前那些明显不对的条带了。
你可以也比对一下，是不是和我的情况类似呢，还有就是设计特引物的时候选择Tm值高的，以便做touch-down PCR。当参考吧，祝你早日成功！
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坚持就是胜利
5楼2014-04-24 11:11:33
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karin

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-04-24 21:31:02
请问怎么拿我的基因和它的基因相比较呢？？...

可以从NCBI上下载到26s序列，在DNAMAN等软件上把你的基因与26s序列比对一下（sequence-alignment）就能看到比对的情况了。
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yoyo单眼皮
坚持就是胜利
7楼2014-04-26 10:04:12
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:53:53
序列里面没有 我的Linker！！！我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊！ 但是有我引物的序列 ，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题 ，但是RACE 就 ...

那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的linker都压根没有看见
说明是PCR时候的错配。
这跟你的检测引物能不能P出来关系不大，那只能说你的模板里面这个基因是表达的，但是不能保证你的模板里面这个基因的cDNA是完整的。
换上游引物，做巢式PCR。提高你PCR的特异性。
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17楼2014-05-08 19:04:53
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普通回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 17:34:18
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592
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2楼2014-04-23 16:01:45
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 17:34:23
race的假阳性问题很常见啊，没什么稀奇的，建议重新设计特异引物再试试

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-23 16:05:34
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-23 16:01:45
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592

什么是非模板A？
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4楼2014-04-23 16:34:30
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by karin at 2014-04-24 11:11:33
我最近也在用CloneTech Smart RACE试剂盒做5’RACE ，换了若干引物，用的touch-down PCR，测了若干2kb、1kb、750bp、500bp条带，都是核糖体28s，18s，5.8s基因簇里的片段。后来我拿自己的基因和这个基因簇对比了一下 ...

请问怎么拿我的基因和它的基因相比较呢？？
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6楼2014-04-24 21:31:02
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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yoyo单眼皮: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-05 16:06:08
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-05-05 20:24:25
这实际上就是PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带，其原因与对策如下：

I.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。可能的具体原因和对策如下：
    1.设立阳性和阴性对照，检查反应体系是否被污染。如果被污染则采用相应的对策消除污染。具体见“二”。
    2.加强DNA聚合酶的专一性。
    （1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
    （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
    （3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
    3.缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
    4.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。
（1）使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
（2）使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
5.适当减少DNA模板量和四中脱氧核苷酸的浓度也能够一定程度上减少非特异性扩增。

II.反应体系被污染：这种污染有两种原因：
    1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
    这种非特异性带出现可用以下方法解决：
   （1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
   （2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
   （3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
   （4）重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
    对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

    前面所有措施都不行，那就只好重新设引物了。本文是2013年11月8日重新编辑的。
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8楼2014-04-26 10:18:50
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by karin at 2014-04-26 10:04:12
可以从NCBI上下载到26s序列，在DNAMAN等软件上把你的基因与26s序列比对一下（sequence-alignment）就能看到比对的情况了。...

谢谢 但对我帮助很大
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9楼2014-05-05 16:06:50
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-23 16:01:45
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592

你的意思是poly A吗？
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10楼2014-05-08 16:57:32
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