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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

[求助] 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢 已有4人参与

应用CloneTech Smart RACE试剂盒做3’RACE 应用试剂盒的UPM引物基因特异性引物 退火58度 延伸2min

得到了750bp 和300bp 的条带 测序 结果都是26S核糖体RNA基因 ，不是我要的基因序列

请问我到底哪里出了错？
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1楼 2014-04-23 15:48:35
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 17:34:18
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592
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2楼2014-04-23 16:01:45
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 16:57:32
你的意思是poly A吗？...

问题还没解决呢？
polyA就是一串A的意思嘛，我的意思是你这串A，必须是基因组上没有的，mRNA上的，也就是转录后加上的。
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11楼2014-05-08 17:57:52
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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13楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:19:32
我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊？？我也懵了...

你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？
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14楼2014-05-08 18:33:20
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biostar2009

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15楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:53:53
序列里面没有 我的Linker！！！我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊！ 但是有我引物的序列 ，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题 ，但是RACE 就 ...

那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的linker都压根没有看见
说明是PCR时候的错配。
这跟你的检测引物能不能P出来关系不大，那只能说你的模板里面这个基因是表达的，但是不能保证你的模板里面这个基因的cDNA是完整的。
换上游引物，做巢式PCR。提高你PCR的特异性。
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17楼2014-05-08 19:04:53
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biostar2009

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16楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 19:00:52
没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带！我感觉我真的是问对人了，求求你帮我分析分析被！！！！！帮我想象办法吧，必有重谢！！！！给钱都行，真心着急！！...

3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物，看不见是比较悬的，
但是你现在不是产物有没有的问题，是产物不特异性的问题。
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18楼2014-05-08 19:12:11
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biostar2009

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21楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 19:17:58
那你说是不是 我的Linker 有问题呢...

。。。什么逻辑，现在跟你的linker没关系。。。
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22楼2014-05-08 19:29:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
yoyo单眼皮: 金币+2 2014-05-08 19:33:42
你还是用的kit。。。换上游引物，一定要设计巢式
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23楼2014-05-08 19:30:56
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