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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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[求助] 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因这是怎么回事求指点！！！！！万分感谢已有4人参与

应用CloneTech Smart RACE试剂盒做3’RACE 应用试剂盒的UPM引物基因特异性引物退火58度延伸2min

得到了750bp 和300bp 的条带测序结果都是26S核糖体RNA基因，不是我要的基因序列

请问我到底哪里出了错？

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1楼 2014-04-23 15:48:35

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biostar2009

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引用回帖:

15楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:53:53
序列里面没有我的Linker！！！我真的不知道怎么回事感觉你好厉害啊！但是有我引物的序列，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题，但是RACE 就 ...

那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的linker都压根没有看见
说明是PCR时候的错配。
这跟你的检测引物能不能P出来关系不大，那只能说你的模板里面这个基因是表达的，但是不能保证你的模板里面这个基因的cDNA是完整的。
换上游引物，做巢式PCR。提高你PCR的特异性。