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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

[求助] 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢已有4人参与

应用CloneTech Smart RACE试剂盒做3’RACE 应用试剂盒的UPM引物基因特异性引物 退火58度 延伸2min

得到了750bp 和300bp 的条带 测序 结果都是26S核糖体RNA基因 ，不是我要的基因序列

请问我到底哪里出了错？
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1楼2014-04-23 15:48:35
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-23 16:01:45
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592

什么是非模板A？
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4楼2014-04-23 16:34:30
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by karin at 2014-04-24 11:11:33
我最近也在用CloneTech Smart RACE试剂盒做5’RACE ，换了若干引物，用的touch-down PCR，测了若干2kb、1kb、750bp、500bp条带，都是核糖体28s，18s，5.8s基因簇里的片段。后来我拿自己的基因和这个基因簇对比了一下 ...

请问怎么拿我的基因和它的基因相比较呢？？
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6楼2014-04-24 21:31:02
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by karin at 2014-04-26 10:04:12
可以从NCBI上下载到26s序列，在DNAMAN等软件上把你的基因与26s序列比对一下（sequence-alignment）就能看到比对的情况了。...

谢谢 但对我帮助很大
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9楼2014-05-05 16:06:50
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-23 16:01:45
仔细分析你得到的序列，你找到了非模板A么？
看看这个：
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7194592

你的意思是poly A吗？
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10楼2014-05-08 16:57:32
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 17:57:52
问题还没解决呢？
polyA就是一串A的意思嘛，我的意思是你这串A，必须是基因组上没有的，mRNA上的，也就是转录后加上的。...

我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊？？我也懵了
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13楼2014-05-08 18:19:32
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？...

序列里面没有 我的Linker！！！我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊！ 但是有我引物的序列 ，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题 ，但是RACE 就是做不出来
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15楼2014-05-08 18:53:53
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？...

没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带！我感觉我真的是问对人了，求求你帮我分析分析被！！！！！帮我想象办法吧，必有重谢！！！！给钱都行，真心着急！！
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16楼2014-05-08 19:00:52
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:04:53
那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的li ...

谢谢你！！！！！真的太感谢了！！！！~ 能遇到你回答我的问题真幸运！！！我再设计几个引物 做巢氏试一试！
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19楼2014-05-08 19:13:22
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:12:11
3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物，看不见是比较悬的，
但是你现在不是产物有没有的问题，是产物不特异性的问题。...

那上游引物是我的基因特异性引物 下游是和Linker 一样的序列进行PCR是吧
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20楼2014-05-08 19:15:21
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