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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3‘RACE序列比对了居然是26S核糖体RNA基因 这是怎么回事 求指点 ！！！！！万分感谢
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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10楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 16:57:32
你的意思是poly A吗？...

问题还没解决呢？
polyA就是一串A的意思嘛，我的意思是你这串A，必须是基因组上没有的，mRNA上的，也就是转录后加上的。
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11楼2014-05-08 17:57:52
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niil

金虫 (正式写手)
这个RACE试剂盒最后反转录出来的cDNA基本是不含有RNA基因的的，而你的则扩增出来RNA，可能有些问题。
1.确定你的总RNA样品是否有DNA污染。
2.分析一下你的测序的750bp和300bp片段两端的引物是什么？是不是单引物扩增产生的？
3.你的基因特异性引物设计的是否符合要求，一般基因特异性引物Tm值高于70℃才好，长度超过25bp。
4.建议采用touchdown PCR、巢式PCR和热启动保真Taq酶。成功率会很高。
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Stop fighting,let it flow.
12楼2014-05-08 18:17:34
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 17:57:52
问题还没解决呢？
polyA就是一串A的意思嘛，我的意思是你这串A，必须是基因组上没有的，mRNA上的，也就是转录后加上的。...

我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊？？我也懵了
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13楼2014-05-08 18:19:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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13楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:19:32
我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊？？我也懵了...

你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？
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14楼2014-05-08 18:33:20
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？...

序列里面没有 我的Linker！！！我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊！ 但是有我引物的序列 ，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题 ，但是RACE 就是做不出来
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15楼2014-05-08 18:53:53
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果，你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物，那你看见你的3‘linker没有？你做了巢式PCR没有？
效率高一点，一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业？...

没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带！我感觉我真的是问对人了，求求你帮我分析分析被！！！！！帮我想象办法吧，必有重谢！！！！给钱都行，真心着急！！
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16楼2014-05-08 19:00:52
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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15楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:53:53
序列里面没有 我的Linker！！！我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊！ 但是有我引物的序列 ，引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因，也就是说模板没问题 ，但是RACE 就 ...

那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的linker都压根没有看见
说明是PCR时候的错配。
这跟你的检测引物能不能P出来关系不大，那只能说你的模板里面这个基因是表达的，但是不能保证你的模板里面这个基因的cDNA是完整的。
换上游引物，做巢式PCR。提高你PCR的特异性。
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17楼2014-05-08 19:04:53
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
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16楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 19:00:52
没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带！我感觉我真的是问对人了，求求你帮我分析分析被！！！！！帮我想象办法吧，必有重谢！！！！给钱都行，真心着急！！...

3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物，看不见是比较悬的，
但是你现在不是产物有没有的问题，是产物不特异性的问题。
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18楼2014-05-08 19:12:11
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:04:53
那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候，有个oligod(T)-linker是吧？
一般情况下，为了避免非特异性，随后PCR的时候，是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆，只看到3’primer，连RT的li ...

谢谢你！！！！！真的太感谢了！！！！~ 能遇到你回答我的问题真幸运！！！我再设计几个引物 做巢氏试一试！
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19楼2014-05-08 19:13:22
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:12:11
3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物，看不见是比较悬的，
但是你现在不是产物有没有的问题，是产物不特异性的问题。...

那上游引物是我的基因特异性引物 下游是和Linker 一样的序列进行PCR是吧
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20楼2014-05-08 19:15:21
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