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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

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10楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 16:57:32
你的意思是poly A吗?...

问题还没解决呢?
polyA就是一串A的意思嘛,我的意思是你这串A,必须是基因组上没有的,mRNA上的,也就是转录后加上的。
11楼2014-05-08 17:57:52
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niil

金虫 (正式写手)

这个RACE试剂盒最后反转录出来的cDNA基本是不含有RNA基因的的,而你的则扩增出来RNA,可能有些问题。
1.确定你的总RNA样品是否有DNA污染。
2.分析一下你的测序的750bp和300bp片段两端的引物是什么?是不是单引物扩增产生的?
3.你的基因特异性引物设计的是否符合要求,一般基因特异性引物Tm值高于70℃才好,长度超过25bp。
4.建议采用touchdown PCR、巢式PCR和热启动保真Taq酶。成功率会很高。
Stop fighting,let it flow.
12楼2014-05-08 18:17:34
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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11楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 17:57:52
问题还没解决呢?
polyA就是一串A的意思嘛,我的意思是你这串A,必须是基因组上没有的,mRNA上的,也就是转录后加上的。...

我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊??我也懵了
13楼2014-05-08 18:19:32
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

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13楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:19:32
我好像测序回来的序列只有引物序列没有一串A或一串T   这是怎么回事啊??我也懵了...

你要仔细看你的测序结果,你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物,那你看见你的3‘linker没有?你做了巢式PCR没有?
效率高一点,一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业?
14楼2014-05-08 18:33:20
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果,你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物,那你看见你的3‘linker没有?你做了巢式PCR没有?
效率高一点,一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业?...

序列里面没有 我的Linker!!!我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊! 但是有我引物的序列 ,引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因,也就是说模板没问题 ,但是RACE 就是做不出来
15楼2014-05-08 18:53:53
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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14楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 18:33:20
你要仔细看你的测序结果,你这个情况就是克隆到了完全非特异性的产物,那你看见你的3‘linker没有?你做了巢式PCR没有?
效率高一点,一个问题解决这么久搞不定。。。你准备几年毕业?...

没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带!我感觉我真的是问对人了,求求你帮我分析分析被!!!!!帮我想象办法吧,必有重谢!!!!给钱都行,真心着急!!
16楼2014-05-08 19:00:52
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

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15楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 18:53:53
序列里面没有 我的Linker!!!我真的不知道怎么回事 感觉你好厉害啊! 但是有我引物的序列 ,引物序列也不是完全匹配的。我也用我设计的一对特异性引物PCR 测序也是我要的基因,也就是说模板没问题 ,但是RACE 就 ...

那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候,有个oligod(T)-linker是吧?
一般情况下,为了避免非特异性,随后PCR的时候,是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆,只看到3’primer,连RT的linker都压根没有看见
说明是PCR时候的错配。
这跟你的检测引物能不能P出来关系不大,那只能说你的模板里面这个基因是表达的,但是不能保证你的模板里面这个基因的cDNA是完整的。
换上游引物,做巢式PCR。提高你PCR的特异性。
17楼2014-05-08 19:04:53
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

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16楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-05-08 19:00:52
没做巢式。。。。说明书上说不做巢式就可以有目的条带!我感觉我真的是问对人了,求求你帮我分析分析被!!!!!帮我想象办法吧,必有重谢!!!!给钱都行,真心着急!!...

3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物,看不见是比较悬的,
但是你现在不是产物有没有的问题,是产物不特异性的问题。
18楼2014-05-08 19:12:11
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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17楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:04:53
那等于你的3’RACE全部失败
做RT的时候,有个oligod(T)-linker是吧?
一般情况下,为了避免非特异性,随后PCR的时候,是针对这个RT的linker再去设计一个3‘primer
如果你最终的克隆,只看到3’primer,连RT的li ...

谢谢你!!!!!真的太感谢了!!!!~ 能遇到你回答我的问题真幸运!!!我再设计几个引物 做巢氏试一试!
19楼2014-05-08 19:13:22
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)

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18楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-08 19:12:11
3‘RACE确实是不做巢式就可以看见产物,看不见是比较悬的,
但是你现在不是产物有没有的问题,是产物不特异性的问题。...

那上游引物是我的基因特异性引物 下游是和Linker 一样的序列进行PCR是吧
20楼2014-05-08 19:15:21
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