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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » pET系列的质粒怎么提？？？
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安小安4302

铁虫 (正式写手)

[求助] pET系列的质粒怎么提？？？ 已有10人参与

最近在提质粒，用生工试剂盒，但是pET这个载体提出的量很少，怎么办？？增加了菌量还是不行，同时提的pUCm-T就很好。求大家给点意见！！！
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不要因为走的太远，以至于忘记了为什么出发！
1楼 2014-04-14 19:57:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

winner00lk

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PET系列质粒大部分都是严谨型，拷贝数较低，每个菌体本身携带的质粒个数较少，如果楼主需要大批量高浓度的话，可能需要大抽质粒后浓缩；PUC是高松弛型，拷贝数叫多，所以较容易提出浓度较高的质粒量。
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我从远方来，没带走一丝遗憾
12楼2014-04-16 10:52:50
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普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
安小安4302: 金币+2, ★有帮助, 在amp在板子上挑的菌呀，也是含amp的液体培养基做的呀 2014-04-14 21:04:25
是不是菌株出问题了，空载体提的也是这个结果吗？

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2楼2014-04-14 20:47:10
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
安小安4302: 金币+2, 谢谢 2014-04-14 21:03:18
看下质粒是松弛型的还是严整型的，有必要的话可以用10ml菌去提
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操蛋的XX
3楼2014-04-14 20:48:47
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
安小安4302: 金币+2, ★有帮助, 就是用的碱裂解呀，要命了 2014-04-14 21:06:07
用分子克隆上的碱裂解法抽提的效果还是挺好的
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4楼2014-04-14 20:56:01
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安小安4302

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangpeng227 at 2014-04-14 20:56:01
用分子克隆上的碱裂解法抽提的效果还是挺好的

就是用的碱裂解呀，用生工试剂盒，两份3ml的菌，16小时摇菌，加到一个吸附柱，还是量很低。不知道该怎么办了
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不要因为走的太远，以至于忘记了为什么出发！
5楼2014-04-14 21:02:53
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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安小安4302(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-04-15 09:02:03
既然楼主同时提取克隆载体质粒没问题，说明问题不是出在质粒提取步骤，应该考虑质粒或菌株差异。楼主所用pET系列载体是卡那霉素抗性吧？pUCm-T是氨苄抗性，所以建议检查你所用的卡那霉素是否时间过长失效导致所培养的菌不纯？建议考虑一下这个因素。另外楼主这两个菌株用的都是克隆菌株吧？如果从表达菌株中提取pET系列载体，出现这种情况不奇怪。
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积累知识，抓紧奋斗！
6楼2014-04-14 21:29:54
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紫风铃豌豆

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-04-15 09:02:07
温度低一些，大离心时时间稍长些，剩下的基本试剂盒差不多~~~
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7楼2014-04-14 21:31:09
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
安小安4302(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-04-15 09:02:13
引用回帖:
5楼: Originally posted by 安小安4302 at 2014-04-14 21:02:53
就是用的碱裂解呀，用生工试剂盒，两份3ml的菌，16小时摇菌，加到一个吸附柱，还是量很低。不知道该怎么办了...

1,2,3液 碱裂解后离心取上清，加入酚仿醇抽提，取上清加等体积乙醇,，离心获得沉淀，沉淀用含RNAse水溶解。

如果仍不能获得质粒，一般来说可能是菌样的问题。
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8楼2014-04-14 22:05:07
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孤城一片

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
嗯！正常，多提几管就是了

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本意探花郎，奈何芷若香；寄意予青陆，共沐好蟾光。
9楼2014-04-15 07:14:36
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my1987

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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安小安4302(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-04-16 11:13:32
我以前遇到过一个情况，就是菌加多了，碱裂解不完全，量很低。加3ml基本提不出什么，加1ml反到提的很好，但是我那个是别的菌，氨苄抗性的，楼主考虑下这个情况吧！我提取pET28a时，摇菌一般就6-7小时，好像加3ml和1ml提出来的量没有差特别大，你摇了这么久会不会出现我上面说的情况。
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10楼2014-04-15 09:26:00
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