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shRNA的构建 已有1人参与
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| 请问做RNA干扰设计的shRNA的启动子必须是RNA聚合酶iii类的启动子么？如果是的话，为什么RNA聚合酶ii的不行呢？？ |
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 分子生化实验经验积累 | 分子生物学技术 |
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biostar2009
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【答案】应助回帖
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ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-13 21:22:07
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哈哈，总算来了一个有意思的问题， 你是怎么想的呢？ polII和polIII的区别，你知道多少呢？ shRNA的作用方式，你又知道多少呢？ 这个必须从shRNA的作用方式说起，所谓RNAi，我们只谈动物中，关键在于siRNA，siRNA由Dicer切割shRNA而来。就这一步，在动植物，高等动物跟低等动物如果蝇线虫之间，就有很大的不同。且不谈。 Dicer切什么样的底物呢？short hairpin-RNA和long double strand RNA，后者多用于果蝇线虫系统。所以哺乳动物细胞中一般都表达shRNA。 作为Dicer最佳底物的shRNA有着结构的要求，其他样子的，切割效率会差。miRNA发现之后已经知道，比shRNA更长的，或者Dicer不能切，但是有hairpin sharp RNA的，被Drosha/DGCR8切。但是很明显，这回极大的降低效率，因为没有哪一步加工会是完全的。 所以，问题的关键回到了如何转录出一个short hairpin RNA 这才到了为什么选择polIII的问题 polIII和polII都有各自的启动子，虽然结构，序列，负责转录的聚合酶不一样，但是也差不多，一般而言+1位也比较固定。 但是区别在于polIII有着明确的终止信号，一般是几个T，5个足够了，你可以发现你设计的shRNA总是以5-6个T结束，这就限定了RNA的大小 但是polII不一样，转录是没有明确的终止这个概念的，所谓的终止就是RNA的polyadenylation，遇见这个信号之后，RNA随后发生切断，加A，但是其实RNA聚合酶还会继续跑一段的。这个不管 问题在于这个加A，这段A首先大小不一，其次一般都比较长，50nt平均肯定有，所以这个会极大的影响shRNA的结构。 所以这些shRNA表达载体，清一色的全是polIII启动子，一般也就用U6和H1 promoter，这两个的结构和起始转录位置研究得很透彻。 |
2楼2014-03-31 20:56:20
3楼2014-03-31 21:59:47
