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biostar2009

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【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+10, MolEPI+1, 非常好! 2014-03-31 21:43:34
ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-13 21:22:07
哈哈,总算来了一个有意思的问题,
你是怎么想的呢?
polII和polIII的区别,你知道多少呢?
shRNA的作用方式,你又知道多少呢?

这个必须从shRNA的作用方式说起,所谓RNAi,我们只谈动物中,关键在于siRNA,siRNA由Dicer切割shRNA而来。就这一步,在动植物,高等动物跟低等动物如果蝇线虫之间,就有很大的不同。且不谈。
Dicer切什么样的底物呢?short hairpin-RNA和long double strand RNA,后者多用于果蝇线虫系统。所以哺乳动物细胞中一般都表达shRNA。
作为Dicer最佳底物的shRNA有着结构的要求,其他样子的,切割效率会差。miRNA发现之后已经知道,比shRNA更长的,或者Dicer不能切,但是有hairpin sharp RNA的,被Drosha/DGCR8切。但是很明显,这回极大的降低效率,因为没有哪一步加工会是完全的。
所以,问题的关键回到了如何转录出一个short hairpin RNA
这才到了为什么选择polIII的问题
polIII和polII都有各自的启动子,虽然结构,序列,负责转录的聚合酶不一样,但是也差不多,一般而言+1位也比较固定。
但是区别在于polIII有着明确的终止信号,一般是几个T,5个足够了,你可以发现你设计的shRNA总是以5-6个T结束,这就限定了RNA的大小
但是polII不一样,转录是没有明确的终止这个概念的,所谓的终止就是RNA的polyadenylation,遇见这个信号之后,RNA随后发生切断,加A,但是其实RNA聚合酶还会继续跑一段的。这个不管
问题在于这个加A,这段A首先大小不一,其次一般都比较长,50nt平均肯定有,所以这个会极大的影响shRNA的结构。
所以这些shRNA表达载体,清一色的全是polIII启动子,一般也就用U6和H1 promoter,这两个的结构和起始转录位置研究得很透彻。
2楼2014-03-31 20:56:20
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