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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » shRNA的构建
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biostar2009

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+10, MolEPI+1, 非常好！ 2014-03-31 21:43:34
ningning915: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-13 21:22:07
哈哈，总算来了一个有意思的问题，
你是怎么想的呢？
polII和polIII的区别，你知道多少呢？
shRNA的作用方式，你又知道多少呢？

这个必须从shRNA的作用方式说起，所谓RNAi，我们只谈动物中，关键在于siRNA，siRNA由Dicer切割shRNA而来。就这一步，在动植物，高等动物跟低等动物如果蝇线虫之间，就有很大的不同。且不谈。
Dicer切什么样的底物呢？short hairpin-RNA和long double strand RNA，后者多用于果蝇线虫系统。所以哺乳动物细胞中一般都表达shRNA。
作为Dicer最佳底物的shRNA有着结构的要求，其他样子的，切割效率会差。miRNA发现之后已经知道，比shRNA更长的，或者Dicer不能切，但是有hairpin sharp RNA的，被Drosha/DGCR8切。但是很明显，这回极大的降低效率，因为没有哪一步加工会是完全的。
所以，问题的关键回到了如何转录出一个short hairpin RNA
这才到了为什么选择polIII的问题
polIII和polII都有各自的启动子，虽然结构，序列，负责转录的聚合酶不一样，但是也差不多，一般而言+1位也比较固定。
但是区别在于polIII有着明确的终止信号，一般是几个T，5个足够了，你可以发现你设计的shRNA总是以5-6个T结束，这就限定了RNA的大小
但是polII不一样，转录是没有明确的终止这个概念的，所谓的终止就是RNA的polyadenylation，遇见这个信号之后，RNA随后发生切断，加A，但是其实RNA聚合酶还会继续跑一段的。这个不管
问题在于这个加A，这段A首先大小不一，其次一般都比较长，50nt平均肯定有，所以这个会极大的影响shRNA的结构。
所以这些shRNA表达载体，清一色的全是polIII启动子，一般也就用U6和H1 promoter，这两个的结构和起始转录位置研究得很透彻。
赞一下(7人) 回复此楼
2楼2014-03-31 20:56:20
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