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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 融合PCR详细步骤
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jza63

铁虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR详细步骤 已有3人参与

请问怎么做融合PCR（重叠延伸PCR），请列出详细步骤，万分感谢
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1楼 2014-03-01 21:20:16
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-02 15:46:04
jza63: 金币+10 2014-03-14 16:06:39
好，来相助一把。
在重叠的一段设计一对完全互补的引物（P1-Reverse和P2-Forward）。
1. 使用引物P1-Forward，P1-Reverse扩增片段Segment1；使用引物P2-Forward，P2-Reverse扩增片段Segment2.
2. 取一些第一轮PCR产物（5ul/25ul即可），重新加入Taq酶和dNTPs，buffer等，延伸一轮，15min左右。
3. 加入P1-Forward和P2-Reverse，进行第二轮PCR。
4.产物回收。
应该可以，具体细节根据你的引物和片段来定。
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2楼2014-03-01 21:27:47
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jza63

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-03-01 21:27:47
好，来相助一把。
在重叠的一段设计一对完全互补的引物（P1-Reverse和P2-Forward）。
1. 使用引物P1-Forward，P1-Reverse扩增片段Segment1；使用引物P2-Forward，P2-Reverse扩增片段Segment2.
2. 取一些第一轮PC ...

那么对引物有啥要求？原引物能用么
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3楼2014-03-02 20:01:57
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-03 08:29:02
就是搭桥PCR啊。设计前片段的反向引物跟后片段正向引物有二十多bp重复。用引物分别扩增片段，然后两片段等mol混合用前片段的正向引物和后片段反向引物扩增。
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hehe
4楼2014-03-02 20:43:28
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我严重统一2楼和3楼的，谢谢大家！
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5楼2014-03-02 23:25:20
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兰舍难分

新虫 (初入文坛)
我想问一下，两段间重复片段如果有700bp，能做出来吗？
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6楼2015-01-19 13:17:56
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 兰舍难分 at 2015-01-19 13:17:56
我想问一下，两段间重复片段如果有700bp，能做出来吗？

我的片段重复了200多bp，能行吗?同问
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7楼2015-11-08 22:09:30
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叶建宏

新虫 (初入文坛)
请问重复序列太多可以么？
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8楼2016-03-07 18:47:12
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zaty95

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 叶建宏 at 2016-03-07 18:47:12
请问重复序列太多可以么？

20-25BP
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越努力，越幸运
9楼2019-09-27 15:52:48
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