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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 新药研发 » 资料求助 » 牛激素蛋白纯化复性研究
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极道始之魔

银虫 (小有名气)

[交流] 牛激素蛋白纯化复性研究

近期在做牛激素的一个相关实验。从质粒构建到表达以及后期的纯化。
1.蛋白的表达量占总蛋白的70%差不多
2.在蛋白纯化过程中，小蛋白洗涤可以去除，但有几条大蛋白很难洗去，不想过柱子，不知道有没什么缓冲液可以洗的，见图
3.在包涵体复性的过程中，发现在复性后的蛋白在透析后，有些许蛋白析出来，但大部分没有，溶液看上去有点极淡蓝色的感觉。
4。做得是一个融合蛋白，不知道是不是只有复性好的蛋白才切的完？每次跑胶都是一半多切完了，，融合蛋白还有一点
5.目的蛋白，下面还有一条蛋白，不知道什么原因。从别的文献看也有这种情况，有时上面浓一点，有时下面浓一点，真是奇怪。同一种蛋白在不同状态下会跑出不一样的条带吗
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1楼 2014-02-19 15:04:58
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wolfman840

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
极道始之魔: 金币+4 2014-02-20 20:11:35
没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多，可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后，蛋白结构改变，导致分子断裂的情况，这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金属键或者原子，例如铜或者镍。
3.你切的氨基酸点一样的话，和复性好不好关系不大啊。只要酶用的对就好。除非你复性后理化环境不适合酶工作。
4.你带MARK了没，没图没真相，不好判断。一般来说就是降解，不过要看距离和条带分布来判断的。
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2楼2014-02-20 11:13:15
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-02-20 11:13:15
没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多，可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后，蛋白结构改变，导致分子断裂的情况，这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金 ...

没用过超滤，不过超滤的话蛋白损失应该很大。
断链的话，就加了nacl和咪唑，这个就没办法了
切这个蛋白的酶也是识别切掉部分空间结构的
可能降解了，但是蛋白一般应该不会降解啊
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3楼2014-02-20 20:14:21
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
图1
牛激素蛋白纯化复性研究
照片(1).JPG
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4楼2014-02-20 20:21:58
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
图2
牛激素蛋白纯化复性研究-1
照片 3.JPG
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5楼2014-02-20 20:23:54
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
图3
牛激素蛋白纯化复性研究-2
照片 1(1).JPG
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6楼2014-02-20 20:26:40
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
图1中，第1条marker，第2条纯化的融合蛋白，第3条酶切后的图片，分子量大小在20kd左右，出现了几条带感觉好奇诡。图2，是透析复性的图。图3是复性完的液倒在烧杯里，现在还不知道复性的蛋白它的溶液是成什么样子的
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8楼2014-02-20 20:31:31
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
极道始之魔: 金币+1 2014-02-20 20:49:50
帮顶，blessing, blessing, blessing ! ~~~
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9楼2014-02-20 20:33:45
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by userhung at 2014-02-20 20:33:45
帮顶，blessing, blessing, blessing ! ~~~

谢谢，希望可以得到解惑
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10楼2014-02-20 20:49:33
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wolfman840

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我看你的电泳图，没啥异常啊，就自下而上的三个条带来说，酶切的那个分子量有点诡异，不过也差不多位置啊。
至于做超滤，得看你的分子量，用5kd的做透析，损失不大的。
看你透析后的溶液，感觉蛋白好浓，是不是聚集了啊
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极道始之魔
12楼2014-02-27 12:52:09
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-02-27 12:52:09
我看你的电泳图，没啥异常啊，就自下而上的三个条带来说，酶切的那个分子量有点诡异，不过也差不多位置啊。
至于做超滤，得看你的分子量，用5kd的做透析，损失不大的。
看你透析后的溶液，感觉蛋白好浓，是不是聚 ...

位置是差不多，但是有2条带，麻烦啊，应该是聚集了。离心的话可以离心出沉淀的。主要是在蛋白复性方面也没有什么人指导，不知道到底接下来要怎么弄
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13楼2014-02-28 15:56:28
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血性红魔7楼
2014-02-20 20:26   回复  
极道始之魔11楼
2014-02-20 20:50   回复  
引用回帖:
7楼: Originally posted by 血性红魔 at 2014-02-20 20:26:52

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