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极道始之魔

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[交流] 牛激素蛋白纯化复性研究

近期在做牛激素的一个相关实验。从质粒构建到表达以及后期的纯化。
1.蛋白的表达量占总蛋白的70%差不多
2.在蛋白纯化过程中，小蛋白洗涤可以去除，但有几条大蛋白很难洗去，不想过柱子，不知道有没什么缓冲液可以洗的，见图
3.在包涵体复性的过程中，发现在复性后的蛋白在透析后，有些许蛋白析出来，但大部分没有，溶液看上去有点极淡蓝色的感觉。
4。做得是一个融合蛋白，不知道是不是只有复性好的蛋白才切的完？每次跑胶都是一半多切完了，，融合蛋白还有一点
5.目的蛋白，下面还有一条蛋白，不知道什么原因。从别的文献看也有这种情况，有时上面浓一点，有时下面浓一点，真是奇怪。同一种蛋白在不同状态下会跑出不一样的条带吗

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1楼 2014-02-19 15:04:58

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极道始之魔

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-02-20 11:13:15
没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多，可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后，蛋白结构改变，导致分子断裂的情况，这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金 ...

没用过超滤，不过超滤的话蛋白损失应该很大。
断链的话，就加了nacl和咪唑，这个就没办法了
切这个蛋白的酶也是识别切掉部分空间结构的
可能降解了，但是蛋白一般应该不会降解啊

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3楼2014-02-20 20:14:21

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wolfman840

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极道始之魔: 金币+4 2014-02-20 20:11:35

没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多，可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后，蛋白结构改变，导致分子断裂的情况，这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金属键或者原子，例如铜或者镍。
3.你切的氨基酸点一样的话，和复性好不好关系不大啊。只要酶用的对就好。除非你复性后理化环境不适合酶工作。
4.你带MARK了没，没图没真相，不好判断。一般来说就是降解，不过要看距离和条带分布来判断的。

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2楼2014-02-20 11:13:15

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