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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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极道始之魔

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[交流] 牛激素蛋白纯化复性研究

近期在做牛激素的一个相关实验。从质粒构建到表达以及后期的纯化。
1.蛋白的表达量占总蛋白的70%差不多
2.在蛋白纯化过程中,小蛋白洗涤可以去除,但有几条大蛋白很难洗去,不想过柱子,不知道有没什么缓冲液可以洗的,见图
3.在包涵体复性的过程中,发现在复性后的蛋白在透析后,有些许蛋白析出来,但大部分没有,溶液看上去有点极淡蓝色的感觉。
4。做得是一个融合蛋白,不知道是不是只有复性好的蛋白才切的完?每次跑胶都是一半多切完了,,融合蛋白还有一点
5.目的蛋白,下面还有一条蛋白,不知道什么原因。从别的文献看也有这种情况,有时上面浓一点,有时下面浓一点,真是奇怪。同一种蛋白在不同状态下会跑出不一样的条带吗
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wolfman840

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极道始之魔: 金币+4 2014-02-20 20:11:35
没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多,可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后,蛋白结构改变,导致分子断裂的情况,这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金属键或者原子,例如铜或者镍。
3.你切的氨基酸点一样的话,和复性好不好关系不大啊。只要酶用的对就好。除非你复性后理化环境不适合酶工作。
4.你带MARK了没,没图没真相,不好判断。一般来说就是降解,不过要看距离和条带分布来判断的。
2楼2014-02-20 11:13:15
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极道始之魔

主管区长

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引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-02-20 11:13:15
没有图啊。
1.小分子蛋白和大蛋白如果分子量差很多,可以用超滤或者梯度离心方法分开。
2.复性蛋白可能存在理化环境改变后,蛋白结构改变,导致分子断裂的情况,这个正常。在你看来极淡蓝色是不是你表达的蛋白有金 ...

没用过超滤,不过超滤的话蛋白损失应该很大。
断链的话,就加了nacl和咪唑,这个就没办法了
切这个蛋白的酶也是识别切掉部分空间结构的
可能降解了,但是蛋白一般应该不会降解啊
3楼2014-02-20 20:14:21
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极道始之魔

管理员

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图1
牛激素蛋白纯化复性研究
照片(1).JPG

4楼2014-02-20 20:21:58
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极道始之魔

超级版主

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图2
牛激素蛋白纯化复性研究-1
照片 3.JPG

5楼2014-02-20 20:23:54
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极道始之魔

管理员

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图3
牛激素蛋白纯化复性研究-2
照片 1(1).JPG

6楼2014-02-20 20:26:40
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极道始之魔

实习版主

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图1中,第1条marker,第2条纯化的融合蛋白,第3条酶切后的图片,分子量大小在20kd左右,出现了几条带感觉好奇诡。图2,是透析复性的图。图3是复性完的液倒在烧杯里,现在还不知道复性的蛋白它的溶液是成什么样子的
8楼2014-02-20 20:31:31
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userhung

实习版主

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极道始之魔: 金币+1 2014-02-20 20:49:50
帮顶,blessing, blessing, blessing ! ~~~
9楼2014-02-20 20:33:45
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极道始之魔

管理员

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引用回帖:
9楼: Originally posted by userhung at 2014-02-20 20:33:45
帮顶,blessing, blessing, blessing ! ~~~

谢谢,希望可以得到解惑
10楼2014-02-20 20:49:33
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wolfman840

主管区长

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我看你的电泳图,没啥异常啊,就自下而上的三个条带来说,酶切的那个分子量有点诡异,不过也差不多位置啊。
至于做超滤,得看你的分子量,用5kd的做透析,损失不大的。
看你透析后的溶液,感觉蛋白好浓,是不是聚集了啊

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12楼2014-02-27 12:52:09
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极道始之魔

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引用回帖:
12楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-02-27 12:52:09
我看你的电泳图,没啥异常啊,就自下而上的三个条带来说,酶切的那个分子量有点诡异,不过也差不多位置啊。
至于做超滤,得看你的分子量,用5kd的做透析,损失不大的。
看你透析后的溶液,感觉蛋白好浓,是不是聚 ...

位置是差不多,但是有2条带,麻烦啊,应该是聚集了。离心的话可以离心出沉淀的。主要是在蛋白复性方面也没有什么人指导,不知道到底接下来要怎么弄
13楼2014-02-28 15:56:28
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2014-02-20 20:26   回复  
2014-02-20 20:50   回复  
引用回帖:
7楼: Originally posted by 血性红魔 at 2014-02-20 20:26:52

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