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有关质粒提取的问题。。。急！！！ 已有2人参与
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| 小弟最近做red重组，用的质粒pkd46（6329bp），每次提完跑胶都在12000左右，应该是形成了二聚体，单酶切后跑胶大小正常。请问下：质粒形成二聚体会影响质粒上基因的表达吗？ |
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yipan 
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| 细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链DNA分子，只有酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。环形双链DNA分子有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型。第二种是开环DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口。第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。细菌细胞中质粒的数目有很大差异。多的每个细胞里可以达几十乃至几百份拷贝，少的则只有一到几份拷贝。高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid)，独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid)，它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。实验证明，同一个大肠杆菌细胞里一般不会同时有两种不同的质粒，这是质粒不相容性(plasmid incompatibility)。在细菌细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥。这样的两种质粒被称为不相容质粒。带有外源DNA的质粒载体转化到大肠杆菌细胞以后，会产生一系列生理效应，影响自身的稳定性。特别是表达型的质粒载体，外源基因的表达会使宿主细胞的生长速率下降，以及质粒载体的丢失等。这种质粒的不稳定性包括分离不稳定性(segregational instability)和结构不稳定性(structural instability)，前者指细菌细胞分裂过程中，有一个子细胞没有得到质粒拷贝，最终使质粒丢失的细胞成为优势群体;后者主要是指由于转座和重组，使质粒DNA重排或缺失。影响质粒载体稳定性的主要因素有：①宿主细胞代谢负荷增加 质粒载体可使宿主细胞的代谢负荷加重，有的能延长其世代时间15%左右。质粒载体的大小同宿主细胞生长延缓的程度呈正相关，这可能是由于质粒载体相对分子质量大，则对宿主细胞DNA复制的负荷更大的缘故。同样，宿主细胞如维持质粒载体中外源基因的表达活性，势必在DNA转录和蛋白质翻译上承受更多的额外负担。②细胞中所含质粒载体的拷贝数 细胞中所含质粒载体的拷贝数各不相同，也是影响质粒丢失的一个因素。拷贝数差别不大时，质粒载体相对地稳定;拷贝数相差悬殊，则很容易造成一些细胞丢失质粒，并逐渐发展为优势群体。③宿主细胞DNA重组系统的作用 质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体(plasmid oligomer)，其稳定性比单体差。此外，质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的程度也密切相关。 |
2楼2014-02-18 13:24:38
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yipan
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质粒自连一般会影响蛋白的表达，而且质粒自连后比较大，不太稳定，而且不容易电转化。你是需要表达那三个功能蛋白的，不建议用自连的质粒去实验。最好是用原先正确的质粒。如你所说可以将自连的质粒单切，单切后做一下简单的自连接，再转化，从而筛到正确的质粒，也有助于实验的进行。 |
5楼2014-02-18 14:23:36
6楼2014-02-18 15:04:22
7楼2014-02-18 16:05:23
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