| 查看: 2523 | 回复: 11 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
liulugang管理员
|
[求助]
有关质粒提取的问题。。。急！！！ 已有2人参与
|
|
| 小弟最近做red重组，用的质粒pkd46（6329bp），每次提完跑胶都在12000左右，应该是形成了二聚体，单酶切后跑胶大小正常。请问下：质粒形成二聚体会影响质粒上基因的表达吗？ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有211人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 重组质粒，摇菌提取质粒后，如何测序？
已经有5人回复
- 质粒提取和扩增鉴定
已经有5人回复
- 质粒快抽有条带，提取时却没有了，什么问题啊？
已经有15人回复
- Fosmid质粒提取问题
已经有7人回复
- 急！ 质粒不相容性 线性的两个质粒还会发生这种现象吗
已经有11人回复
- 大提质粒遇到的问题
已经有10人回复
- 求助：重组质粒酶切问题！请大家帮我解决一下，急！
已经有7人回复
- 请帮我看看提取质粒的图是出了什么问题
已经有19人回复
- 关于质粒pCAMBIA1301的验证
已经有4人回复
- 想请教下有关测序的问题！急！！！
已经有10人回复
- 求助关于质粒提取的若干问题，谢谢了！！
已经有5人回复
- 国际上有没有比较全的质粒库，可以购买质粒？
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于质粒DNA转化中，Ca离子的作用问题.谢谢！
已经有11人回复
yipan 
兑换贵宾
- MolEPI: 1
- 应助: 214 (大学生)
- 金币: 16410.4
- 散金: 275
- 红花: 6
- 帖子: 4184
- 在线: 195.9小时
- 虫号: 2743878
- 注册: 2013-10-22
- 性别: GG
- 专业: 整合生物学
4楼2014-02-18 14:18:30
yipan
专家顾问
- MolEPI: 1
- 应助: 214 (大学生)
- 金币: 16410.4
- 散金: 275
- 红花: 6
- 帖子: 4184
- 在线: 195.9小时
- 虫号: 2743878
- 注册: 2013-10-22
- 性别: GG
- 专业: 整合生物学
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liulugang: 金币+2, ★有帮助 2014-02-19 13:30:50
感谢参与，应助指数 +1
liulugang: 金币+2, ★有帮助 2014-02-19 13:30:50
| 细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链DNA分子，只有酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。环形双链DNA分子有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(covalently close circular DNA，ccc DNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型。第二种是开环DNA(open circularDNA，oc DNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口。第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。细菌细胞中质粒的数目有很大差异。多的每个细胞里可以达几十乃至几百份拷贝，少的则只有一到几份拷贝。高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid)，独立于细菌细胞而自主复制;低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid)，它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。实验证明，同一个大肠杆菌细胞里一般不会同时有两种不同的质粒，这是质粒不相容性(plasmid incompatibility)。在细菌细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥。这样的两种质粒被称为不相容质粒。带有外源DNA的质粒载体转化到大肠杆菌细胞以后，会产生一系列生理效应，影响自身的稳定性。特别是表达型的质粒载体，外源基因的表达会使宿主细胞的生长速率下降，以及质粒载体的丢失等。这种质粒的不稳定性包括分离不稳定性(segregational instability)和结构不稳定性(structural instability)，前者指细菌细胞分裂过程中，有一个子细胞没有得到质粒拷贝，最终使质粒丢失的细胞成为优势群体;后者主要是指由于转座和重组，使质粒DNA重排或缺失。影响质粒载体稳定性的主要因素有：①宿主细胞代谢负荷增加 质粒载体可使宿主细胞的代谢负荷加重，有的能延长其世代时间15%左右。质粒载体的大小同宿主细胞生长延缓的程度呈正相关，这可能是由于质粒载体相对分子质量大，则对宿主细胞DNA复制的负荷更大的缘故。同样，宿主细胞如维持质粒载体中外源基因的表达活性，势必在DNA转录和蛋白质翻译上承受更多的额外负担。②细胞中所含质粒载体的拷贝数 细胞中所含质粒载体的拷贝数各不相同，也是影响质粒丢失的一个因素。拷贝数差别不大时，质粒载体相对地稳定;拷贝数相差悬殊，则很容易造成一些细胞丢失质粒，并逐渐发展为优势群体。③宿主细胞DNA重组系统的作用 质粒载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体(plasmid oligomer)，其稳定性比单体差。此外，质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的程度也密切相关。 |
2楼2014-02-18 13:24:38
liulugang
管理员
- 应助: 10 (幼儿园)
- 金币: 3335
- 散金: 100
- 红花: 1
- 帖子: 189
- 在线: 76.2小时
- 虫号: 1899861
- 注册: 2012-07-18
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
3楼2014-02-18 14:17:20
朱多龙
实习版主
- 应助: 40 (小学生)
- 金币: 4389.8
- 红花: 10
- 帖子: 221
- 在线: 389.2小时
- 虫号: 2055828
- 注册: 2012-10-12
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 18:01:36
liulugang: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-19 13:30:39
liulugang: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-19 13:33:23
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 18:01:36
liulugang: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-19 13:30:39
liulugang: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-19 13:33:23
|
质粒自连一般会影响蛋白的表达，而且质粒自连后比较大，不太稳定，而且不容易电转化。你是需要表达那三个功能蛋白的，不建议用自连的质粒去实验。最好是用原先正确的质粒。如你所说可以将自连的质粒单切，单切后做一下简单的自连接，再转化，从而筛到正确的质粒，也有助于实验的进行。 |
5楼2014-02-18 14:23:36
10