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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] HPLC问题求助高手已有3人参与

2000年购买的Bio-Rad 公司的Biologic DuoFlow Chromatography System,一直用于分析蛋白质(凝胶色谱及离子交换色谱)。最近3-4年没有人使用了,一直闲置。现在想用于反相HPLC分析,所以新买了C18色谱柱,但还没有连接上C18色谱柱。准备先试验一下系统是否还工作。遇到了麻烦。

流动相A: 0.1% TFA/水;流动相B: 0.1% 乙腈。使用前,2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。

开始试验系统。流动相:A 90%, B 10%,走3分钟;然后A从 90%到0%, B从 10%到100%,走25分钟。

可以看到,没有连接色谱柱的情况下,色谱图出现很多峰,特别是在走梯度的时候。如果单纯走水,没有这些峰。

水占90%的时候,峰也很少。好像是每间隔2分钟,就出1个峰。是气泡峰吗?还是以前管线里面沉积的蛋白残留物?

本人没有操作过HPLC,是新手,身边没有人请教。现请教小木虫上都专家和高手,怎么解决?万分感谢!
HPLC问题求助高手
HPLC-BioLogic DuoFlow.PNG
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wang2005054

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
费姚永芬: 金币+2, 谢谢,欢迎常来分析版交流 2014-02-08 12:25:30
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流,欢迎常来分析版 2014-02-11 08:13:35
多走几次吧,对比图谱是否一致,如果有杂质,图谱会随清洗次数增加而发生变化,如果图谱一致没变化,说明乙腈可能有问题!这样可以排除乙腈的问题!然后再换其它牌号、批次的乙腈做对比,总之,多走几个图谱再说!!!
10楼2014-02-08 08:18:18
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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费姚永芬: 金币+1, 谢谢 2014-02-08 12:24:44
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流,欢迎常来分析版 2014-02-11 08:14:38
不一定是乙腈的问题,你把AB两相都换成纯化水,在走一下,如果还这样,应该是仪器的问题。你的仪器很久没用,管路、泵、检测器都有可能状态不好,看你的基线,我的直觉是泵有问题,排除流动相原因,有可能是步进电机或控制主板有问题,你接上一根阻尼管或色谱柱观察一下压力波动情况。
快乐不需要走遍天涯去寻找,只需播一粒种子在脚下。
11楼2014-02-08 08:50:33
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普通回帖

whynotbest

至尊木虫 (职业作家)

淫虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流,欢迎常来分析版,辛苦了 2014-02-11 08:13:53
先看看你的乙腈是不是有问题吧
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2楼2014-02-08 02:04:24
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
2楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:04:24
先看看你的乙腈是不是有问题吧

乙腈是EMD公司的HPLC专用乙腈。

产品订购来源:
https://ca.vwr.com/store/catalog ... g_number=CAAX0145-1

产品检验报告:https://ca.vwr.com/stibo/hi_res/10646475.pdf
小木虫-知识宝库的入口。今天,你小木虫了没有?
3楼2014-02-08 02:42:16
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whynotbest

至尊木虫 (职业作家)

淫虫

引用回帖:
3楼: Originally posted by bobcanada at 2014-02-08 02:42:16
乙腈是EMD公司的HPLC专用乙腈。

产品订购来源:
https://ca.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=CAAX0145-1

产品检验报告:https://ca.vwr.com/stibo/hi_res/10646475.pdf...

不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试
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4楼2014-02-08 02:48:08
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
4楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:48:08
不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试...

流动相A: 0.1% TFA/水;流动相B:甲醇。使用前,2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。

开始试验系统。流动相:A 90%, B 10%,走3分钟;然后A从 90%到0%, B从 10%到100%,走25分钟。

可以看到,没有连接色谱柱的情况下,色谱图出现很多峰,特别是在走梯度的时候。如果单纯走水,没有这些峰。
HPLC问题求助高手-1
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5楼2014-02-08 03:56:13
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

1楼错误更正:流动相A: 0.1% TFA/水;流动相B: 0.1% TFA/乙腈。
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6楼2014-02-08 03:57:59
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

在没有连接上色谱柱(只是单纯的管路连接)的情况下,分别用甲醇和乙腈作为流动相B,梯度(B 10% for 3 mins, then B 10%-100% in 25 mins)走的色谱图。哪里来的那么多杂峰?是管路内的蛋白沉积物,还是气泡?
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7楼2014-02-08 04:03:32
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
4楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:48:08
不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试...

如何检查HPLC专用的乙腈或甲醇是否有问题?我没有经验。谢谢!
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8楼2014-02-08 04:06:07
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wx_55

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流,欢迎常来分析版,辛苦了 2014-02-11 08:14:20
再换一个牌子的乙腈试试,或者换另外一个批次的乙腈试试,再或者先用热水或高浓度乙腈长时间冲刷管路
9楼2014-02-08 07:24:03
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