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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] HPLC问题求助高手 已有3人参与

2000年购买的Bio-Rad 公司的Biologic DuoFlow Chromatography System，一直用于分析蛋白质（凝胶色谱及离子交换色谱）。最近3－4年没有人使用了，一直闲置。现在想用于反相HPLC分析，所以新买了C18色谱柱，但还没有连接上C18色谱柱。准备先试验一下系统是否还工作。遇到了麻烦。

流动相A: 0.1% TFA/水；流动相B: 0.1% 乙腈。使用前，2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。

开始试验系统。流动相：A 90%， B 10%，走3分钟；然后A从 90%到0%， B从 10%到100%，走25分钟。

可以看到，没有连接色谱柱的情况下，色谱图出现很多峰，特别是在走梯度的时候。如果单纯走水，没有这些峰。

水占90%的时候，峰也很少。好像是每间隔2分钟，就出1个峰。是气泡峰吗？还是以前管线里面沉积的蛋白残留物？

本人没有操作过HPLC，是新手，身边没有人请教。现请教小木虫上都专家和高手，怎么解决？万分感谢！
HPLC问题求助高手
HPLC-BioLogic DuoFlow.PNG
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小木虫-知识宝库的入口。今天，你小木虫了没有？
1楼 2014-02-07 22:41:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wang2005054

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
费姚永芬: 金币+2, 谢谢，欢迎常来分析版交流 2014-02-08 12:25:30
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流，欢迎常来分析版 2014-02-11 08:13:35
多走几次吧，对比图谱是否一致，如果有杂质，图谱会随清洗次数增加而发生变化，如果图谱一致没变化，说明乙腈可能有问题！这样可以排除乙腈的问题！然后再换其它牌号、批次的乙腈做对比，总之，多走几个图谱再说！！！
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10楼2014-02-08 08:18:18
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
费姚永芬: 金币+1, 谢谢 2014-02-08 12:24:44
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流，欢迎常来分析版 2014-02-11 08:14:38
不一定是乙腈的问题，你把AB两相都换成纯化水，在走一下，如果还这样，应该是仪器的问题。你的仪器很久没用，管路、泵、检测器都有可能状态不好，看你的基线，我的直觉是泵有问题，排除流动相原因，有可能是步进电机或控制主板有问题，你接上一根阻尼管或色谱柱观察一下压力波动情况。
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快乐不需要走遍天涯去寻找，只需播一粒种子在脚下。
11楼2014-02-08 08:50:33
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普通回帖

whynotbest

至尊木虫 (职业作家)

淫虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流，欢迎常来分析版，辛苦了 2014-02-11 08:13:53
先看看你的乙腈是不是有问题吧
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2楼2014-02-08 02:04:24
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
2楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:04:24
先看看你的乙腈是不是有问题吧

乙腈是EMD公司的HPLC专用乙腈。

产品订购来源：
https://ca.vwr.com/store/catalog ... g_number=CAAX0145-1

产品检验报告：https://ca.vwr.com/stibo/hi_res/10646475.pdf
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3楼2014-02-08 02:42:16
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whynotbest

至尊木虫 (职业作家)

淫虫
引用回帖:
3楼: Originally posted by bobcanada at 2014-02-08 02:42:16
乙腈是EMD公司的HPLC专用乙腈。

产品订购来源：
https://ca.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=CAAX0145-1

产品检验报告：https://ca.vwr.com/stibo/hi_res/10646475.pdf...

不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试
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4楼2014-02-08 02:48:08
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
4楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:48:08
不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试...

流动相A: 0.1% TFA/水；流动相B:甲醇。使用前，2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。

开始试验系统。流动相：A 90%， B 10%，走3分钟；然后A从 90%到0%， B从 10%到100%，走25分钟。

可以看到，没有连接色谱柱的情况下，色谱图出现很多峰，特别是在走梯度的时候。如果单纯走水，没有这些峰。
HPLC问题求助高手-1
hplc-methanol.PNG
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5楼2014-02-08 03:56:13
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)
1楼错误更正：流动相A: 0.1% TFA/水；流动相B: 0.1% TFA/乙腈。
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6楼2014-02-08 03:57:59
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)
在没有连接上色谱柱（只是单纯的管路连接）的情况下，分别用甲醇和乙腈作为流动相B，梯度（B 10% for 3 mins, then B 10%－100% in 25 mins）走的色谱图。哪里来的那么多杂峰？是管路内的蛋白沉积物，还是气泡？
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7楼2014-02-08 04:03:32
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
4楼: Originally posted by whynotbest at 2014-02-08 02:48:08
不管你乙腈是哪里来的 你起码可以一个个排除可能的因素试试...

如何检查HPLC专用的乙腈或甲醇是否有问题？我没有经验。谢谢！
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8楼2014-02-08 04:06:07
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wx_55

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流，欢迎常来分析版，辛苦了 2014-02-11 08:14:20
再换一个牌子的乙腈试试，或者换另外一个批次的乙腈试试，再或者先用热水或高浓度乙腈长时间冲刷管路
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9楼2014-02-08 07:24:03
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