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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » HPLC问题求助高手
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bobcanada

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] HPLC问题求助高手 已有3人参与

2000年购买的Bio-Rad 公司的Biologic DuoFlow Chromatography System，一直用于分析蛋白质（凝胶色谱及离子交换色谱）。最近3－4年没有人使用了，一直闲置。现在想用于反相HPLC分析，所以新买了C18色谱柱，但还没有连接上C18色谱柱。准备先试验一下系统是否还工作。遇到了麻烦。

流动相A: 0.1% TFA/水；流动相B: 0.1% 乙腈。使用前，2个流动相溶液都分别用超声波清洗器做15分钟脱气处理。

开始试验系统。流动相：A 90%， B 10%，走3分钟；然后A从 90%到0%， B从 10%到100%，走25分钟。

可以看到，没有连接色谱柱的情况下，色谱图出现很多峰，特别是在走梯度的时候。如果单纯走水，没有这些峰。

水占90%的时候，峰也很少。好像是每间隔2分钟，就出1个峰。是气泡峰吗？还是以前管线里面沉积的蛋白残留物？

本人没有操作过HPLC，是新手，身边没有人请教。现请教小木虫上都专家和高手，怎么解决？万分感谢！
HPLC问题求助高手
HPLC-BioLogic DuoFlow.PNG
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小木虫-知识宝库的入口。今天，你小木虫了没有？
1楼 2014-02-07 22:41:39
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
费姚永芬: 金币+1, 谢谢 2014-02-08 12:24:44
bobcanada(费姚永芬代发): 金币+5, 谢谢交流，欢迎常来分析版 2014-02-11 08:14:38
不一定是乙腈的问题，你把AB两相都换成纯化水，在走一下，如果还这样，应该是仪器的问题。你的仪器很久没用，管路、泵、检测器都有可能状态不好，看你的基线，我的直觉是泵有问题，排除流动相原因，有可能是步进电机或控制主板有问题，你接上一根阻尼管或色谱柱观察一下压力波动情况。
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快乐不需要走遍天涯去寻找，只需播一粒种子在脚下。
11楼2014-02-08 08:50:33
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
费姚永芬: 金币+2, 谢谢交流，欢迎常来分析版 2014-02-11 08:15:42
bobcanada: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-14 03:03:36
因为你有几年没用，所以你的管路可能较“脏”，你冲洗管路时，可能管路中一些东西污染你的单向阀，导致单向阀不能正常工作，你可以清洗单向阀试一试，不接柱子，用异丙醇做流动相，1.0ml/min，30min，两个泵可以同时冲洗。步进电机也不排除有问题，我有一台仪器和你的状态一样，等度没问题，梯度基线和你的状态一样脉冲厉害，后来换了主板上的一个电容就OK了。另，你的检测器是那一种？电导？示差折光？紫外？
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22楼2014-02-09 09:08:14
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
bobcanada: 金币+8, ★★★很有帮助 2014-02-14 23:05:15
你的现象是流速越大，毛刺越小。我个人判断为步进电机或控制步进电机电流的主板有问题，单向阀也不排除。如果实验室有同型号仪器，你可以把坏仪器上的配件逐一换到好的仪器上测试，进口单向阀、出口单向阀、步进电机、主板。 如果是主板问题，工程师一般要求换整块主板，如果你身边有对电子电路比较熟悉的高手，可以让他帮你测试，看看是哪些电子元件故障，买同型号的换上即可，小心注意，这种板是多层电路板。简单一点也可以用吹风吹一下主板上的飞尘，也可以用无水乙醇洗一洗主板，吹干后再试。 祝你好运！
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28楼2014-02-14 09:05:05
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by bobcanada at 2014-02-18 22:24:31
请问，是否是我没有连接上C18柱的原因，连接上柱子后，压力就会增大，是否就没有噪音峰或毛刺了？是不是高效液相不能在不连接色谱柱的情况下低压运行呢？...

不是。这样的毛刺与接不接柱子没关系，你可以接柱试一试，你冲洗那么久，不会脏柱子。
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35楼2014-02-19 08:25:26
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kf1009

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
40楼: Originally posted by bobcanada at 2014-02-20 03:42:23
今天去化学系问了一个做HPLC-MS的人，他感觉是我的泵有问题。我回来后，用30%的异丙醇水溶液走了一会，双泵的都使用30%的异丙醇水溶液作为流动相，结果没有什么杂峰。看来，A、B泵分别使用不同的流动相溶液，走不走 ...

如果是这样，你走单泵时应该也没毛刺。你以前冲甲醇、异丙醇时时也应该没毛刺。 不管以前怎样，现在能用就行。
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41楼2014-02-20 09:07:55
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