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【求助】请问杂质HPLC检查时，如何确定检测波长
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| 请问杂质HPLC检查时，如何确定检测波长，急！ |
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sunnybluesea(金币+20): 很好 谢谢 2011-02-21 13:01:43
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转贴以下内容供LZ参考： http://www.med66.com/html/ziliao ... 8c1fc3bf14d65d9.htm 关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论 【临床药学讨论版】 关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论审评二部张玉琥 有 关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查 ，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的 要求 ,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。 有关物质检查常用的方法之一 是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC色谱图中杂质峰面积与主成分 自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。采用此方法时确定的检测波 长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容 。 在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或 间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若 将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂 质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质 量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价 在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有： 1．直接将主药的最 大吸收波长选作检测波长。 2．简单地套用含量测定的色谱条件。在HPLC法进行含量 测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测 波长。若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检 测波长。 3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外 扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。因破坏性试验后溶液 中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的 加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。由于未破坏主药所占比例较大，故破坏 性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。 采用HPLC主成分自身 对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有 相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存在的杂质（合成 原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。已知杂质的紫外吸 收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物 等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外 吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。若对不同杂质难于 找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因 子的主成分自身对照法。只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检 查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的 色谱条件一致。 另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质 总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。对于具有明确归属 的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。对于有毒有害杂质，更应采用杂质对 照品法单独测定，并制定严格的限度。 http://pharma.dxy.cn/news/50/54/19125.htm 不同波长下测定药品有关物质的讨论 某片剂，主药在220nm、254nm下均有较强吸收，254nm吸收值约比220nm大一倍，含量测定采用254nm，现想对该药物进行有关物质检查，波长初步选择为254nm，经查国内外相关文献，并无该药品的有关物质检查报道，我们想在质量研究中增加在不同波长下考察有关物质的大小试验。 现分别采用220nm和254nm进行同一份样品进行有关物质检测，大致现象为  1)220nm：杂质峰面积明显增大，主峰峰面积明显减小，故归一化法杂质明显增大，总杂质约1.5%，新增2个杂质，共5个杂质；(2)254nm：杂质峰面积小，主峰面积大，归一化法总杂质约0.3%，共3个杂质；试问，在这种情况下，该如何合理的对比杂质大小、个数？我资料中体现了粗品与强制降解产物的全波长扫描，当时考虑到各杂质的最大吸收均 在280nm，因此就选择了280nm作为有关物质的检测波长，当时也比较了低波长处的 归一化限度均小于280nm，但是没有写到资料里去，因此感觉比较冤。 这也体现出目前对杂质研究的重视，对于杂质来说在有较强吸收的地方，分别比较杂 质的检出个数与总量，最终根据杂质的量与个数确定合适的波长，当然DAD检测器成 为首选，以粗品与降解产物进行DAD测定是目前的基本要求，审核人员希望看到你为 建立专属性强的方法做了全面的工作，所选波长基本能检出所有杂质，并且杂质量也 是最多的。曾经咨询过专家的意见，很多品种含量下降与有关物质增加不符合，甚至 相差5～10倍，建立专属的有关物质方法是现在审核的中心。 基于上述理由严重建议做充分的工作，比较粗品与强制降解产物的杂质检出个数与数 量（你新增的杂质不一定是新增，可能由于浓度低而未检出，采用强制降解一般不会 出现上述问题，毕竟有关物质与样品的母体基本相同），最终确定有关物质波长，你 的理论上应该选择220nm而非254nm。最好以DAD检测器得到的结果来证明。 首先254nm是苯环的B带吸收。1.杂质如果在此没有吸收的话，他很可能不具有苯环结构，这样的杂质有点超出一般意义下的杂质，这样的杂质与主药没有直接的关系，可能来源于合成的起始原料等，具体可以参考合成工艺分析，由于一般带有苯环的不太会后加苯环，这样的可能性比较小。2.杂质在254你们有最大吸收，单由于杂质的吸收度小无法检测出，这样的选择254nm是可以的。或者在此的吸收系数比较小，这样的需要加校正因子校正。 选择低波长是比较有风险的，国家局的意思也是要跟低波长处的进行比较，他可能希 望到此处的数据，譬如210nm检出0.5%杂质，280nm检出0.4%杂质，但是低波长的干扰较大，或者某些残留溶剂再此也有峰，选择280nm也是可以的，210nm0.5%的杂质、280nm0.4%的，你选择280nm总会找出一些理由，如果你没有给出低波长下的数据审评人员心里没数可能就要补你，固确定多出的这2个杂质是需要关注的。 “说得有点复杂哈，简单一点，主药和杂质通常情况下在一个波长下均有吸收，怎么 证明我选择主药的最大吸收是合理的？” 证明杂质与主药的相应因子在0.9～1.1之间，也可以反推220nm的相应因子超过了1.1， 所以检出的量是大的、假的。实际上制剂大于0.2%的未知杂质需要结构确证的，因此 最好搞到该杂质的对照品，证明其220nm处其相应因子不在0.9～1.1之间。原料是合法来源，但可能没有控制有关物质，如果有控建议参考其标准。220nm杂质已经超标，最好不表述。如果表述则需要证明其不合理性。否则上述信息让审评人员知道，1.5%与0.3%不研究明白肯定让你再行研究。 实际上制剂大于0.2%的未知杂质需要结构确证的，因此最好搞到该杂质的对照品，证 明其220nm处其相应因子不在0.9～1.1之间。 摩尔吸收系数的比值在0.9～1.1，这是使用主成分自身对照法的冲要条件，否则需采 用自身对照法或者加校正因子的主成分自身对照法等。这一切的前提都是得到杂质对 照品，目前制剂杂质大于0.2%的也需要拿到杂质对照品，并进行结构确证，确定安全 性，目前申报的门槛大大提高了，是我辈的不幸啊。如果时间不允许也只能装作不知 道，看审评中心的老师是否知道，他也不知道那就万事大吉，他知道那只能再补。你 这个品种一旦涉及到220nm，你里面就有超过0.2%的杂质，需要按照指导原则进行， 目前的政策就是不能有超过0.2%的杂质出现，超过了结构确证，有文献报道该杂质安 全，则不需要进行安全性试验，否则进行。 220nm：杂质峰面积明显增大，主峰峰面积明显减小，故归一化法杂质明显增大，总 杂质约1.5%，新增2个杂质，共5个杂质；在220nm处归一化法检测杂质要充分考虑辅料的干扰，因为辅料在此波长均有很强的吸收，若为小剂量产品，小药丸説的在 220nm主药和杂质各占50%左右是很有可能的，若必需在220nm处检测杂质，一定要减去辅料的吸收，但辅料降解产物的影响仍然是未知数。 有关物质波长的选择最好是有杂质对照品，先确定每个杂质的最大吸收波长，然后选 择主药最大吸收波长附近的波长作为检测波长，且该波长下杂质要有较大的吸收值， 然后研究响应因子。此条国内一般不愿去做，工作量大，费用高，但是是以后的方向 。 选择粗品和破坏的全波段扫描，来确定不同波长下的有关物质情况，比如杂质数目， 杂质的归一化百分比等，但是不是有关越高越好，最好还是选择和主药与杂质的最大 吸收波长最接近的波长。 个人认为，有关物质的研究在国内还是处在尴尬的境地，即使选择了杂质最大的波长 仍然不能保证把所有杂质都检测出来，用液相方法只是比薄层先进些罢了，细想还是 很可笑的。好多工作不可能去做，所以，只能想些办法，只要能够说服评审老师就行 了，口服制剂花那么大功夫研究本来就有问题的问题，实在是浪费。 应找到合适的理由将有关物质的检测波长定在254nm，否定220nm是关键 http://www.sepu.net/dvbbs/dispbb ... p;page=0&star=1 做有关物质常常需要看看产品与它的最后几步中间体是否能分得开对吧？我的做法是 把产品和中间体都配成相同浓度的溶液，在紫外上扫描，然后找一个产品和中间体有 相似吸收的波长作为HPLC的检测波长，并不一定要选产品的最大吸收波长，请问这 样对吗？今天下午问了一个做新药的前辈，可他说一般都是选择的产品的最大吸收波 长。但是我的几个中间体在产品的最大吸收处吸收都很小，这样怎么能起到检测的作 用呢？因为即使终产品带有大量的中间体，在HPLC上也只能检测出一点甚至是检测 不出来，那么这个有关物质的方法还有什么意义？前辈给的说法是如果中间体没有什 么安全性方面的问题，这些都无所谓！我就疑惑了。请高手指点！ 谢谢各位了。其实要是只选择在一个波长下来检测有关物质，总有弊端的不是，因为 样品、中间体、副产物及降解产物他们的吸收不尽相同，甚至有的相差特别大，如果 他们的含量都比较高的话，有的东西根本检测不出来的。有人说应该不同的有关物质 选不同的波长检测，这样也许会好一点，但是目前的新药研究好像没有这么细致，再 说有的中间体含量甚少，而有的杂质又是未知的，得不到对照的东西，也就无从下手 ，看来也就只好随波逐流选一个样品的最大吸收波长先做了，时间太紧了！再次感谢 各位哈！ 这不是随波逐流，这也是一种方法，有时候理论和实践不可能同意的很好！！ 如果你把标准定成很多波长检测有关物质，对以后的检验会非常不利，质量标准要定 的即合理又科学！！只科学，不合理是不成功的质量标准。 就像你的前辈的说法，如果中间体没有什么安全性方面的问题，可以不用考虑那么多 ！！ 对于已知的杂质，也不一定选择杂质的最大吸收波长来检查！！因为你应该有 杂质对照！！ 如果根本没有紫外吸收，多数可以不做考察；如果非得做考察，可以采用ELSD或RI 检测，或者采用TLC的方法，用显色法检查。 |
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