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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 微生物、发酵 » MTT法测细胞活力
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lilanluo

金虫 (著名写手)

[求助] MTT法测细胞活力 已有3人参与

本人现在用MTT法做测试食用菌液体菌种活力的实验，做下来发现各种各样的问题。请教下各位前辈，跪请帮助
首先有四个疑问，为什么MTT法生成的甲臜是蓝紫色结晶物质，可是检测波长却定在560或570nm（此波长下颜色是黄色和绿色），我做实验过程中产生不少黄色物质，蓝紫色物质不稳定，PS，我用异丙醇溶解MTTf。第二，产生的蓝紫色物质总是贴在塑料的离心管壁上，产生多贴得就多，我用的是可见紫外分光光度计做这个实验（实验室没有酶标仪），要取出溶解MTTF后的液体，这样造成很大的误差，要怎么才不会粘在管壁上。第三，MTT与菌体的反应温度真是让我抓狂，温度越高在560nm处测得的吸光值越高，在50摄氏度之前的温度下基本上没反应，之后温度越高产生的物质的吸光值越高。
跪求能人来解达，同道中人来探讨，感谢一万次。
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小硕毕业散户
1楼 2014-01-08 17:01:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小毛孩24

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lilanluo at 2014-01-09 09:53:42
谢谢。我也不知道为什么要这么高的温度。但实验结果就是这样。我的实验材料是食用菌液体菌种，可能是细胞壁和细菌不一样，有一篇文献说50摄氏度。贴壁的情况你没遇到吗？真奇怪，我自做这个实验以来，用的塑料离心 ...

我用MTT做的细胞，在细胞培养板里做的。
按照原理，是MTT和琥珀酸脱氢酶反应，所以温度不应该那么高
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5楼2014-01-09 15:24:55
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zouqiaoling

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lilanluo at 2014-01-10 14:43:08
菌体发酵实验，是食用菌，大型真菌的液体发酵。温度高的问题我也不理解。发酵温度是28度。各位有没有做过高温的，高温加入MTT培养有什么现象呢？...

真菌发酵确定可以用MTT 检测？我们做的都是细胞的，菌体发酵的没做过
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做一个快乐的人
9楼2014-01-10 16:11:00
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普通回帖

lilanluo

金虫 (著名写手)
我知道颜色问题了，这是因为吸收波长在500－600被测溶液是蓝紫色，而且用不同溶剂波长不一样（这个和文献符合，做实验也可以验证），就是很难理解。
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小硕毕业散户
2楼2014-01-08 21:43:54
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilanluo: 金币+1, ★有帮助 2014-01-09 09:53:55
生成的甲臜要溶解的，震荡一下甲臜不就不贴壁了
MTT的反应是酶促反应，37度反应就好了，为什么要50以上？反应要2-4小时
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3楼2014-01-09 09:24:57
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lilanluo

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-01-09 09:24:57
生成的甲臜要溶解的，震荡一下甲臜不就不贴壁了
MTT的反应是酶促反应，37度反应就好了，为什么要50以上？反应要2-4小时

谢谢。我也不知道为什么要这么高的温度。但实验结果就是这样。我的实验材料是食用菌液体菌种，可能是细胞壁和细菌不一样，有一篇文献说50摄氏度。贴壁的情况你没遇到吗？真奇怪，我自做这个实验以来，用的塑料离心管不管用什么方法上面的蓝紫色就是洗 不下来，超声啊、加热、振荡。您的管壁上真的没有颜色粘在上面？会不会是因为用的材料不一样，请问你用什么材料的管子。
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小硕毕业散户
4楼2014-01-09 09:53:42
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lilanluo

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-01-09 15:24:55
我用MTT做的细胞，在细胞培养板里做的。
按照原理，是MTT和琥珀酸脱氢酶反应，所以温度不应该那么高...

6楼2014-01-09 15:33:21
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zouqiaoling

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lilanluo: 金币+1, ★有帮助 2014-01-10 14:43:16
lilanluo: 金币+10, ★有帮助 2014-03-23 17:57:44
MTT 应用PBS溶解吧
用酶标仪吧，不然太不准了
做过好多mtt，没感觉温度的影响，细胞都是在37度和MTT在培养箱里反应
或者没看懂楼主的意图啊，请问您是做的细胞实验么还是菌体的发酵
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做一个快乐的人
7楼2014-01-09 20:02:02
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lilanluo

金虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zouqiaoling at 2014-01-09 20:02:02
MTT 应用PBS溶解吧
用酶标仪吧，不然太不准了
做过好多mtt，没感觉温度的影响，细胞都是在37度和MTT在培养箱里反应
或者没看懂楼主的意图啊，请问您是做的细胞实验么还是菌体的发酵

菌体发酵实验，是食用菌，大型真菌的液体发酵。温度高的问题我也不理解。发酵温度是28度。各位有没有做过高温的，高温加入MTT培养有什么现象呢？
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小硕毕业散户
8楼2014-01-10 14:43:08
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lilanluo

金虫 (著名写手)
现在做了个小实验，用大肠杆菌加MTT在37和50度下反应，同时灵芝菌液加MTT在50度下反应。结果很明显，大肠杆菌37度下反应1小时颜色是绿色的，不是纯的绿。灵芝菌在50度都没有什么颜色变化，还是MTT的颜色。
至于粘壁，大肠杆菌反应液在塑料离心管底部有一层紫色物质粘着，估计和我之前做的一样，弄不下来，时间短点可能就不会粘在上面了；大肠杆菌反应液在玻璃试管里没有那一层紫色的东东。
这就说明了，灵芝菌肯定不适合这样做，我认为是细胞壁的问题，估计要破壁才会有效果。
感谢各位的回答。
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小硕毕业散户
10楼2014-01-12 17:20:07
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