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镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来 已有4人参与
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镍柱纯化带有组氨酸标签的蛋白，用了各种浓度的咪唑进行洗脱还是洗脱不下来，蛋白还是挂在柱子上，怎么办啊，感觉看不到希望了，希望大家帮我分析一下，发不了文章就毕不了业啦。好郁闷啊 由于蛋白表达量少所以选择将酶液多次上柱，洗脱液是由50mM pH7.5的PBS配制，氯化钠浓度为400mM 1:10mM咪唑洗脱；2:15mM咪唑洗脱；3:20mM咪唑洗脱；4:50mM咪唑洗脱；5:500微升200mM咪唑洗脱；6:1毫升500mM咪唑洗脱；7:1毫升1000mM咪唑洗脱；8:最后离心剩下的resin；从第8泳道可以看出大部分蛋白还是挂在柱子上的。纯化后要得到有活性的蛋白，计算回收率。如果在升高咪唑浓度怕高浓度咪唑会影响到酶的活性。但是现在的回收率太低了，怎样才能提高纯化效率啊？  图片1.jpg |
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