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[求助]
链霉菌基因组DNA的大提
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我有几株链霉菌想要提取基因组DNA后做杂交，大提DNA的方法是改良的CTAB法，最后虽然提取的量比较少，但是能用玻璃棒搅丝，之后用70%的乙醇洗盐，再之后风干（风干彻底），再之后用0.1xSSC溶解，却溶解不了，SSC是最新配制的，而且第一次提取的时候出现不溶解的情况，又重新配制了ssc···第二次还是不溶解。求大神指导。 或者哪位大神之前大提过链霉菌的DNA，求方法啊，我已经提了一个多月了，真心已经黔驴技穷了··· |
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另外，我们长期提取链霉菌总DNA都是用溶菌酶方法提取的，你也可以试一下用此法小量提取下gDNA。 1. 取一干净Ep管，添加30 ul菌丝体至500 ul SET buffer，加10 ul Lysozyme solution (50 mg/ml)，混匀后37℃ 水浴30 min； 2. 加14 ul proteinase K solution (20 mg/ml), 混匀后添加60 ul 10% SDS溶液，混匀，55℃水浴1h； 3. 加200 ul 5 M NaCl solution并混合均匀； 4. 加500 ul酚仿溶液（Phenol/chloroform/isoamylol=25:24:1），混匀后高速离心，12000 rpm离心10 min； 5. 上清转移至干净的Ep管，加500 ul氯仿，混匀后高速离心； 6. 移取上清至干净Ep管，添加0.6 倍异戊醇，混匀后高速离心； 7. 弃上清，加1 ml 70% 乙醇，重悬DNA，12000 rpm 离心10 min； 8. 重复步骤7洗涤gDNA； 9. 将gDNA用水溶解。 SET buffer: NaCl 75 mM EDTA (pH8.0) 25 mM Tris-Cl (pH7.5) 20 mM 注意：菌丝体的量和其他试剂用量都可以根据需要调节，还有样品处理时间要根据实际情况调节，一般都会有所延长。 希望你能顺利解决这一问题！ |
9楼2013-12-24 09:46:09
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2013-12-23 21:38:05
dgm1208: 金币+30, ★★★很有帮助, 谢谢你哈，之前由于操作失误把之前的100金币都给了bikexmx，又追加的，金币不多，谢谢你 2013-12-26 18:19:51
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方法一：如果这种菌能长成菌落 ，你就用宝生物的这个试剂盒来提一下（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR），这个很便宜。 方法二：如果这个试剂盒不可以的话，你就用德国QIAGEN的试剂盒，这个大约1500，有点贵。 这些应该没有问题，你试试吧。 希望能帮到你 |
2楼2013-12-23 21:13:54
3楼2013-12-23 22:04:00
【答案】应助回帖
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dgm1208: 金币+70, ★★★★★最佳答案, 谢谢你哈，之前由于操作失误把之前的100金币都给了bikexmx，又追加的，金币不多，谢谢你 2013-12-26 18:19:04
dgm1208: 金币+70, ★★★★★最佳答案, 谢谢你哈，之前由于操作失误把之前的100金币都给了bikexmx，又追加的，金币不多，谢谢你 2013-12-26 18:19:04
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不好意思，刚才在路上用手机回复的，发现全是乱码。 我感觉你的问题出在DNA风干，我们实验室提取链霉菌总DNA后，用75%乙醇脱盐两次，然后稍稍spin一下用移液枪吸掉液体，敞口在超净台或工作台面放置几分钟至闻不到乙醇味道，随后加水或TE溶解DNA。混匀一下在55度水浴锅内放置5-10分钟促溶一下就可以了。注意一定不要将总DNA完全风干！祝好运！ |
4楼2013-12-23 22:36:06
5楼2013-12-24 08:48:25
6楼2013-12-24 08:49:45
7楼2013-12-24 09:17:12
8楼2013-12-24 09:34:28
10楼2013-12-24 11:54:53