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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌基因组DNA的大提
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dgm1208

银虫 (小有名气)

[求助] 链霉菌基因组DNA的大提

我有几株链霉菌想要提取基因组DNA后做杂交，大提DNA的方法是改良的CTAB法，最后虽然提取的量比较少，但是能用玻璃棒搅丝，之后用70%的乙醇洗盐，再之后风干（风干彻底），再之后用0.1xSSC溶解，却溶解不了，SSC是最新配制的，而且第一次提取的时候出现不溶解的情况，又重新配制了ssc···第二次还是不溶解。求大神指导。
或者哪位大神之前大提过链霉菌的DNA，求方法啊，我已经提了一个多月了，真心已经黔驴技穷了···
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科研路艰辛···
1楼2013-12-23 16:43:49
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taoway

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by taoway at 2013-12-24 09:34:28
细菌总DNA提取后都不能完全风干，风干到干瘪的透明状态后就再也不能溶解了，很多人吃过这样的亏！我的意思是你敞口放置几分钟到没有乙醇味道就可以溶解了，随后加热促溶一下，注意絮状DNA一定不能完全风干。我们实 ...

另外，我们长期提取链霉菌总DNA都是用溶菌酶方法提取的，你也可以试一下用此法小量提取下gDNA。
1.        取一干净Ep管，添加30 ul菌丝体至500 ul SET buffer，加10 ul Lysozyme solution (50 mg/ml)，混匀后37℃ 水浴30 min；
2.        加14 ul proteinase K solution (20 mg/ml), 混匀后添加60 ul 10% SDS溶液，混匀，55℃水浴1h；
3.        加200 ul 5 M NaCl solution并混合均匀；
4.        加500 ul酚仿溶液（Phenol/chloroform/isoamylol=25:24:1），混匀后高速离心，12000 rpm离心10 min；
5.        上清转移至干净的Ep管，加500 ul氯仿，混匀后高速离心；
6.        移取上清至干净Ep管，添加0.6 倍异戊醇，混匀后高速离心；
7.        弃上清，加1 ml 70% 乙醇，重悬DNA，12000 rpm 离心10 min；
8.        重复步骤7洗涤gDNA；
9.        将gDNA用水溶解。
SET buffer:  NaCl          75 mM
           EDTA (pH8.0)   25 mM   
           Tris-Cl (pH7.5)  20 mM
注意：菌丝体的量和其他试剂用量都可以根据需要调节，还有样品处理时间要根据实际情况调节，一般都会有所延长。
希望你能顺利解决这一问题！
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9楼2013-12-24 09:46:09
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开云者

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2013-12-23 21:38:05
dgm1208: 金币+30, ★★★很有帮助, 谢谢你哈，之前由于操作失误把之前的100金币都给了bikexmx，又追加的，金币不多，谢谢你 2013-12-26 18:19:51
方法一：如果这种菌能长成菌落 ，你就用宝生物的这个试剂盒来提一下（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR），这个很便宜。
方法二：如果这个试剂盒不可以的话，你就用德国QIAGEN的试剂盒，这个大约1500，有点贵。
这些应该没有问题，你试试吧。
希望能帮到你
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挥霍不起青春
2楼2013-12-23 21:13:54
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taoway

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
鎬籇NA涓?鑳借繃鍒嗘尌骞诧紝涔欓唶鑴辩�?�?庣敥涓嬫恫浣擄紝鐢ㄧЩ娑插櫒�?告帀娑蹭綋锛屾暈�?ｆ斁缃嚑鍒嗛挓鑷抽椈涓?鍒颁箼閱囧懗�?撳氨�?互鍔犳按鎴朾uffer婧惰В銆傜劧�?庣疆浜�55搴︽按娴翠釜10鍒嗛挓灏卞?互浜嗐�傜�?濂借�?

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3楼2013-12-23 22:04:00
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taoway

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
dgm1208: 金币+70, ★★★★★最佳答案, 谢谢你哈，之前由于操作失误把之前的100金币都给了bikexmx，又追加的，金币不多，谢谢你 2013-12-26 18:19:04
不好意思，刚才在路上用手机回复的，发现全是乱码。
我感觉你的问题出在DNA风干，我们实验室提取链霉菌总DNA后，用75%乙醇脱盐两次，然后稍稍spin一下用移液枪吸掉液体，敞口在超净台或工作台面放置几分钟至闻不到乙醇味道，随后加水或TE溶解DNA。混匀一下在55度水浴锅内放置5-10分钟促溶一下就可以了。注意一定不要将总DNA完全风干！祝好运！
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4楼2013-12-23 22:36:06
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