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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这样的跑胶结果让我很崩溃
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

[求助] 这样的跑胶结果让我很崩溃 已有11人参与

我是名实验新手，最近扩基因，为什么老是出现这种情况？？好几次我都快崩溃了。退火温度58-61度，（这次maker没跑开，跑开了也是这样的结果）。前几次还会出现各种各样的意想不到的结果，有时有目的条带，但是前后都会有很长的“尾巴”，真心不知道怎么回事了。我都快崩溃了，各位神，指导一下吧。感激不尽。
这样的跑胶结果让我很崩溃
IMG_20131212_204454.jpg
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1楼 2013-12-12 22:49:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mouhaobin

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 15:26:41
KEVIN_LOVE: 金币+2, ★有帮助 2013-12-15 23:45:37
这很明显是胶没有做好：做胶和核酸染料
如果只是PCR的问题，Marker绝对不会这样。既然出现了这种情况，就是胶的问题了。如果是琼脂糖的话，要反复煮沸3次。等胶彻底凝固了再点样跑胶（夏天至少30min，冬天可适当缩短）。核酸染料也是很重要的，当然EB的灵敏度最高，Gel red也不错。
楼主可以具体说下你做胶的过程吗？
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5楼2013-12-13 09:30:42
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mouhaobin

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by KEVIN_LOVE at 2013-12-13 21:57:16
我用的是1的胶，100毫升加1克琼脂糖，微波炉里加热5分子，然后加10微升Dured，再加热2分钟，倒胶，凝固20多分钟，之后跑胶。每次我摸着都凝固了啊...

煮沸了有没有摇匀？胶不均匀，对电泳的影响很大的。煮沸了要拿出来摇几下，这样反复3次。用DuRed是没有问题的，所以你这个现象可以排除核酸染料的问题。还有跑胶的电压也很重要的
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14楼2013-12-14 13:27:20
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普通回帖

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-13 15:26:24
根据我的经验，很有可能是引物特异性的问题，或者聚合酶太差了。
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2楼2013-12-12 23:30:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-13 15:26:31
模板是什么，PCR前是否定量或者跑胶检测？
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3楼2013-12-13 00:28:23
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把你pcr的体系说一下，看看是不是模版加多了等问题……
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我不会！
4楼2013-12-13 08:38:19
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-13 00:28:23
模板是什么，PCR前是否定量或者跑胶检测？

模板是cDNA，直接以cDNA为模板进行的PCR，之前没有跑胶
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6楼2013-12-13 21:54:56
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mouhaobin at 2013-12-13 09:30:42
这很明显是胶没有做好：做胶和核酸染料
如果只是PCR的问题，Marker绝对不会这样。既然出现了这种情况，就是胶的问题了。如果是琼脂糖的话，要反复煮沸3次。等胶彻底凝固了再点样跑胶（夏天至少30min，冬天可适当缩 ...

我用的是1的胶，100毫升加1克琼脂糖，微波炉里加热5分子，然后加10微升Dured，再加热2分钟，倒胶，凝固20多分钟，之后跑胶。每次我摸着都凝固了啊
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7楼2013-12-13 21:57:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by KEVIN_LOVE at 2013-12-13 21:54:56
模板是cDNA，直接以cDNA为模板进行的PCR，之前没有跑胶...

用你的cDNA模板P一下其他基因，如内参，看看是不是cDNA的质量或者用量的问题。
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8楼2013-12-14 00:50:06
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dororo150

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
9楼2013-12-14 01:13:24
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jiaqing2

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
要不是引物特异性不好，要不是模板加多了，建议把模板稀释10倍或者100倍再试试
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好好学习，天天向上
10楼2013-12-14 06:32:20
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