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echochen1017

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] PCR后的产物需要纯化么

我从一个质粒上P一段基因下来，两段有设计酶切位点，也都加了保护碱基，PCR完事后需要纯化一下再酶切么？我没纯化酶切，有条带，然后连接也是双酶切处理过的载体，转化，一个转化子都没有，求解救！
另，从菌株中提质粒，提出来了，验证后，40μL体系酶切，后跑胶验证，什么都没有，碎的条带都没有，泪！！！请问这是什么情况呢？？

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1楼 2013-12-04 14:15:48

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-05 21:03:48

直接切也可以，看酶。有些酶对离子强度敏感的就不好说。一般回收后再做酶切的效果更好。
做克隆按照protocol中的用量来会提高成功率。
你提的质粒浓度多少，用了多少酶切，上样量多少。做了对照没有？

2楼2013-12-04 15:48:22

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湖畔狂想

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-05 21:03:56

建议回收后再继续做，PCR体系中还有好多其他离子，可能对后续实验干扰。

3楼2013-12-05 17:13:17

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