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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR后的产物需要纯化么

我从一个质粒上P一段基因下来,两段有设计酶切位点,也都加了保护碱基,PCR完事后需要纯化一下再酶切么?我没纯化酶切,有条带,然后连接也是双酶切处理过的载体,转化,一个转化子都没有,求解救!
另,从菌株中提质粒,提出来了,验证后,40μL体系酶切,后跑胶验证,什么都没有,碎的条带都没有,泪!!!请问这是什么情况呢??
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湖畔狂想

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-05 21:03:56
建议回收后再继续做,PCR体系中还有好多其他离子,可能对后续实验干扰。
3楼2013-12-05 17:13:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-05 21:03:48
直接切也可以,看酶。有些酶对离子强度敏感的就不好说。一般回收后再做酶切的效果更好。
做克隆按照protocol中的用量来会提高成功率。
你提的质粒浓度多少,用了多少酶切,上样量多少。做了对照没有?
2楼2013-12-04 15:48:22
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