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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

[求助] 质粒连接问题

我在做载体构建,PUC19上连了一个片段,精提质粒验证,PCR验证,双酶切验证都正确,为什么单酶切出现好几条带呢?注,单酶切在质粒上只有一个酶切位点。
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幸福就是一种心态~
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chaorenxmc

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-14 08:28:07
单酶切的图呢,跑胶用没有酶切的原质粒作对照了吗,有可能单酶切没切开
2楼2013-10-13 19:40:51
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xiaozhu20131

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-14 08:28:02
连了一个片段?这一段内可能有酶切位点。。。
面对现实,只有努力。。。
3楼2013-10-13 20:13:13
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wcfbio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-14 08:27:58
酶切验证是不好做的,有时候就出现特别情况,是否你的载体上,或者目的片段上有酶切位点,这个你一定要细心,实在不行拿出去测序分析。
对于誓言一定要实现。
4楼2013-10-13 23:20:50
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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wcfbio at 2013-10-13 23:20:50
酶切验证是不好做的,有时候就出现特别情况,是否你的载体上,或者目的片段上有酶切位点,这个你一定要细心,实在不行拿出去测序分析。

片段上和质粒上都没有,后来又做了,感觉是切得不完全
幸福就是一种心态~
5楼2013-10-16 19:00:05
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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaozhu20131 at 2013-10-13 20:13:13
连了一个片段?这一段内可能有酶切位点。。。

没有酶切位点的,很确定,又检查了一遍。
幸福就是一种心态~
6楼2013-10-16 19:00:45
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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chaorenxmc at 2013-10-13 19:40:51
单酶切的图呢,跑胶用没有酶切的原质粒作对照了吗,有可能单酶切没切开

从左到右依次是(前八个泳道)没有酶切的PUC19-A、双酶切验证、双酶切验证、EcoR1单酶切验证、Kpn1单酶切验证、50000Marker、Ba条带,Kpn1单酶切验证和BamH1单酶切验证正确,约3100bp,可是最后一道Pst1单酶切切得条带比3100要高,请问是什么原因?不同酶单酶切同一个载体后不应该是同一个长度吗?注,所用酶在载体上只有一个酶切位点。

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幸福就是一种心态~
7楼2013-10-17 10:52:51
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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaozhu20131 at 2013-10-13 20:13:13
连了一个片段?这一段内可能有酶切位点。。。

不是,又查了一遍,只有一个。
幸福就是一种心态~
8楼2013-10-17 10:55:27
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fengbing1116

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wcfbio at 2013-10-13 23:20:50
酶切验证是不好做的,有时候就出现特别情况,是否你的载体上,或者目的片段上有酶切位点,这个你一定要细心,实在不行拿出去测序分析。

嗯,拿去测序了,现在是不同没进行单酶切切得高度不一样,为什么呢?
幸福就是一种心态~
9楼2013-10-17 10:56:11
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-18 02:27:41
不知你回收的时候条带亮度怎样?如果很亮的话建议你稍微增加一点限制性内切酶的用量,并适当延长时间。再就是检查一下你的限制性内切酶在公用buffer中的活性怎样,如果两种酶在公用buffer中活性相差很大,会出现一个酶切位点已经完全切开,而另一个酶切位点却没有完全切开,这样就会出现多条条带。
我给不了你宝马香车,锦衣玉食,但我会用一辈子去疼你,爱你,保护你
10楼2013-10-17 11:45:56
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