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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-page 原核表达蛋白 电泳条带弥散
汕头大学海洋科学接受调剂
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hijiwei

新虫 (初入文坛)

[交流] SDS-page 原核表达蛋白 电泳条带弥散 已有6人参与

求助，最近做了N块胶，有15%的分离胶，也有5%-20%的梯度胶跑出来的蛋白不成条带？？以前不这样啊？
菌液IPTG诱导完，离心沉淀菌体，PBS重悬，加4XSDS上样缓冲液（终浓度为1X）煮沸5min，13000rpm离心12min，在4℃保存，第二天电泳。 \"SDS-page
 \"SDS-page
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1楼 2013-10-06 20:23:00
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xiaoche

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-10-07 11:21:11
会不会有降解啊？有没有蛋白酶抑制剂啊？
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2楼2013-10-06 23:07:08
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蓝冰天山

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能配胶缓冲液或者电泳缓冲液有问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2013-10-07 20:47:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-10-07 21:43:40
SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

楼主的图看不见，更具楼主的情况加上一条：
3.原因三.原核细胞的表达产物发生了降解或者提前终止了翻译。
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4楼2013-10-07 21:20:59
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gazellef

新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoche at 2013-10-06 23:07:08
会不会有降解啊？有没有蛋白酶抑制剂啊？

蛋白降解的可能性偏小。又不是核算。一天之内，不太可能有大的影响。
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5楼2014-06-20 22:25:55
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dongmings

木虫之王 (文学泰斗)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议你把上样缓冲液和电泳缓冲液重新配一下试试
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6楼2014-11-22 15:22:40
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陈静和陈鹏

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能跟你的电泳条件和目的片段大小有关系，我做SDS-PAGE的条件是60V跑半个小时，过浓缩胶，然后120V跑1h，目的片段有60Kda的、40KDa以及20KDa。样品变性完直接上样进行电泳。胶浓度为12%，你换一下胶浓度和电泳条件，可以通过你的Marker来判断。希望能帮到你，祝你试验成功。
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7楼2014-11-22 15:33:43
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