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jerryzyy

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[求助] 梯度荧光定量的程序如何设置

我正在做荧光定量，做的是土壤微生物的绝对定量，用普通的PCR扩增用的是梯度PCR，即退火温度从67-57度，每个循环降低0.5度，20个循环后，退火57，12个循环，我想知道，做荧光定量的时候我这个程序应该怎么设置，主要是后面溶解曲线的时候如果不是梯度PCR的话，直接从65升到95，每循环升5度，来做溶解曲线，而我现在如果是梯度PCR的话，这个溶解曲线这块应该怎么设置，请高手指点！非常感谢！

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1楼 2013-10-02 16:24:16

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

熔解曲线就是一般方法设置。做熔解曲线是在反应完全进行完毕后通过逐步升高温度来看产物降解的过程，通过检测产物在熔解曲线峰的情况来判断产物是否单一。所以，无论你前面做了怎样的PCR，熔解曲线的做法是基本一样的。设置从Tm+5开始到95°C。通常的产物不会在70°C以下熔解，你的情况可以从67°C设置起始熔解曲线的温度。

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jerryzyy

2楼2013-10-04 05:16:18

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发展才是硬道理！

3楼2013-10-04 10:41:09

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jerryzyy

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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-04 05:16:18
熔解曲线就是一般方法设置。做熔解曲线是在反应完全进行完毕后通过逐步升高温度来看产物降解的过程，通过检测产物在熔解曲线峰的情况来判断产物是否单一。所以，无论你前面做了怎样的PCR，熔解曲线的做法是基本一样 ...

我现在发现荧光定量不能做降落的，获取荧光信息的时候只能在一个循环中获取，下一个循环中就获取不了了。

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4楼2013-10-04 20:33:25

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jerryzyy

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虽然做不了了，还是谢谢你1

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5楼2013-10-04 20:48:00

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猪猪

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4楼: Originally posted by jerryzyy at 2013-10-04 20:33:25
我现在发现荧光定量不能做降落的，获取荧光信息的时候只能在一个循环中获取，下一个循环中就获取不了了。...

荧光定量是可以做温度梯度的，这应该和仪器有关，我们用的是step
one PLUS，一块板上最多可以设置6个退火温度。

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6楼2013-10-05 09:22:16

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jerryzyy

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6楼: Originally posted by 猪猪 at 2013-10-05 09:22:16
荧光定量是可以做温度梯度的，这应该和仪器有关，我们用的是step
one PLUS，一块板上最多可以设置6个退火温度。...

可以做梯度ＰＣＲ，但是降落荧光ＰＣＲ设定不了啊，获取荧光信号只能出现在一个循环中，而降落ＰＣＲ是有两个变性，退火，延伸的循环啊，这个也跟机器不一样有关吗？

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7楼2013-10-07 14:39:33

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猪猪

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7楼: Originally posted by jerryzyy at 2013-10-07 14:39:33
可以做梯度ＰＣＲ，但是降落荧光ＰＣＲ设定不了啊，获取荧光信号只能出现在一个循环中，而降落ＰＣＲ是有两个变性，退火，延伸的循环啊，这个也跟机器不一样有关吗？...

确实是只能在一个循环中获取荧光信号。。。

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8楼2013-10-15 17:17:07

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西瓜

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你是哪家的仪器？ABI的仪器是可以随便设置的。

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9楼2013-10-15 20:43:21

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蓝天天1989

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9楼: Originally posted by 西瓜 at 2013-10-15 20:43:21
你是哪家的仪器？ABI的仪器是可以随便设置的。

荧光捕获一可以随便设置吗？？

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10楼2014-05-04 11:17:29

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