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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 求助——荧光定量程序设计问题

在荧光程序设计上 一般说明书上的程序是 95 30s , 95  5s , 60  30s , 39个循环,95  10s ,65  5s , 95  5s 。  其中的60度 退火这一步 可以改成54,55 等其他温度吗??因为我用不同PCR扩的时候,在54度才有条带,到了60度就什么都没有了,用60度做荧光定量我觉得可定做不出来啊。。(我用60度跑过程序,CT值差不多在35个循环以后,那就不可信了啊)    求大神指点。。。。。急急

[ Last edited by 1949stone on 2013-9-22 at 12:02 ]
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微生物小硕
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qureen

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wangcheng2650 at 2013-09-22 16:12:35
可以,按照普通PCR运行就行,把荧光收集设定在延伸那一步就好!自己试试就知道了,不要小马过河!...

请问荧光收集怎么设定啊, 能给个具体参数吗
8楼2013-09-22 23:50:36
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-22 12:12:03
绝对可以!弄清楚原理撒!
日子是混出来的!
2楼2013-09-22 11:59:18
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-23 08:53:52
60度是退火加延伸。一般两步法把这两步合并了,要改动的话建议改为三步法.60度不是最佳延伸温度,低于60度taq的延伸速度更慢,所以退火温度调低时要加延伸步骤,并调整延伸时间。
3楼2013-09-22 13:41:24
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学术问题

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-22 13:41:24
60度是退火加延伸。一般两步法把这两步合并了,要改动的话建议改为三步法.60度不是最佳延伸温度,低于60度taq的延伸速度更慢,所以退火温度调低时要加延伸步骤,并调整延伸时间。

上面有一点说错了  我是做的普通PCR (不是不同PCR),在54度有条带,60度就没有了。 也就是说我可以把荧光定量的程序中60度 改成 54度是吧??
微生物小硕
4楼2013-09-22 15:52:03
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