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怎么测膜蛋白
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| 想测肿瘤细胞膜蛋白的表达，但细胞内也有该蛋白，用哪些方法可以检测？ |
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 细胞生物学实验经验 |
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2楼2013-09-06 12:15:57
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7楼2013-09-06 20:34:21
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【答案】应助回帖
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首先把细胞膜分离出来，接着在分离膜蛋白就行了。 很多公司有膜蛋白提取试剂盒，用有机溶剂抽提的，不用超速离心，普通的离心机就可以。具体实验方案，可以参考有关细胞生物学实验手册，或者试剂盒说明书。下面以大鼠肝脏中细胞膜的分离举例说明操作步骤。 举例： 大鼠肝脏中细胞膜的分离 一、.试剂：匀浆介质：25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化镁溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4 高密度蔗糖溶液：2.0mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化镁溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4 向以上两种溶液中加入蛋白酶抑制剂。 二、实验动物：成年雄性大鼠一只 三、器材：低温冷冻离心机、匀浆器、血液尼龙过滤网（孔径750um)、注射器（带金属套管针）、超速离心机。 四、操作步骤： 以下所有实验操作在4度环境下进行。 1.提取麻醉后刚刚处死的大鼠肝脏并称重，然后在冰上烧杯中用剪刀完全剁碎。事先对大鼠麻醉，并对其门静脉灌注20mL匀浆介质。 2.用剁碎物在匀浆介质中混匀（大约4mL/g肝脏）。 3.用匀浆器对于剁碎物进行匀浆。 5.用血液尼龙过滤网去除未被粉碎的细胞和结缔组织，并用玻璃棒搅拌以利于过滤。 6.用浓度为5mL/g的匀浆介质来稀释滤液，分装于两个50mL的离心管中，在280g下离心10分钟。 7.用浓度为粉碎细胞后分离离心细胞成分，匀浆，即可分离出细胞膜。 8.用注射器和金属套管针吸取上清液。 9.在280g下离心获得的上清液在1500g下离心10分钟；缓慢倒掉上清液。 10.再使用匀浆器对1500g下离心10分钟得到的沉淀物放入25mL的匀浆介质中重悬，与2倍前面液体的体积的高密度蔗糖溶液混匀。 11.用Beckman（或者其他品牌）的离心机在113000g离心1小时，如果样品体积不够离心管的装液标准，则用匀浆介质加以补充。 12.用注射器和金属套管针吸取在界面上呈带状分布的细胞膜片段。 13.用匀浆介质将12得到的混悬液适当稀释后（离心管的装液标准），在离心机上用3000g离心10分钟以收集细胞膜。 |
8楼2013-09-06 23:23:43
