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flyinghui

铜虫 (小有名气)

[求助] 怎么测膜蛋白

想测肿瘤细胞膜蛋白的表达，但细胞内也有该蛋白，用哪些方法可以检测？
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细胞生物学实验经验

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1楼 2013-09-06 11:26:54
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

首先把细胞膜分离出来，接着在分离膜蛋白就行了。

很多公司有膜蛋白提取试剂盒，用有机溶剂抽提的，不用超速离心，普通的离心机就可以。具体实验方案，可以参考有关细胞生物学实验手册，或者试剂盒说明书。下面以大鼠肝脏中细胞膜的分离举例说明操作步骤。

举例：
大鼠肝脏中细胞膜的分离
一、.试剂：匀浆介质：25mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化镁溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4
高密度蔗糖溶液：2.0mol/L蔗糖溶液、1mmol/L氯化镁溶液、10mmol/L Tris-HCl,pH=7.4
向以上两种溶液中加入蛋白酶抑制剂。
二、实验动物：成年雄性大鼠一只
三、器材：低温冷冻离心机、匀浆器、血液尼龙过滤网（孔径750um)、注射器（带金属套管针）、超速离心机。
四、操作步骤：
以下所有实验操作在4度环境下进行。
1.提取麻醉后刚刚处死的大鼠肝脏并称重，然后在冰上烧杯中用剪刀完全剁碎。事先对大鼠麻醉，并对其门静脉灌注20mL匀浆介质。
2.用剁碎物在匀浆介质中混匀（大约4mL/g肝脏）。
3.用匀浆器对于剁碎物进行匀浆。
5.用血液尼龙过滤网去除未被粉碎的细胞和结缔组织，并用玻璃棒搅拌以利于过滤。
6.用浓度为5mL/g的匀浆介质来稀释滤液，分装于两个50mL的离心管中，在280g下离心10分钟。
7.用浓度为粉碎细胞后分离离心细胞成分，匀浆，即可分离出细胞膜。
8.用注射器和金属套管针吸取上清液。
9.在280g下离心获得的上清液在1500g下离心10分钟；缓慢倒掉上清液。
10.再使用匀浆器对1500g下离心10分钟得到的沉淀物放入25mL的匀浆介质中重悬，与2倍前面液体的体积的高密度蔗糖溶液混匀。
11.用Beckman（或者其他品牌）的离心机在113000g离心1小时，如果样品体积不够离心管的装液标准，则用匀浆介质加以补充。
12.用注射器和金属套管针吸取在界面上呈带状分布的细胞膜片段。
13.用匀浆介质将12得到的混悬液适当稀释后（离心管的装液标准），在离心机上用3000g离心10分钟以收集细胞膜。
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8楼2013-09-06 23:23:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这样问问题，没有办法回答你。你要具体问什么，请你说具体些。
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2楼2013-09-06 12:15:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

“想测肿瘤细胞膜蛋白的表达，但细胞内也有该蛋白，用哪些方法可以检测”，表达量？表达位点？与时间的表达关系？蛋白质在生物膜上的装配？蛋白质的空间结构和折叠状态？蛋白质的折叠路径？蛋白质的基因表达调控因子？蛋白质的基因表达调控网络？蛋白质的功能实现的相互作用网络？可以检测的东西多了去了。请你说明白你要检测什么？希望用什么实验技术检测？不然我给你写出几千字，你一句话：我不检测这些！我们实验室没有这样的技术设备！我不是白写了吗？
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3楼2013-09-06 12:21:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我晚些时间回答你。
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5楼2013-09-06 12:26:08
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