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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变失败
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] 定点突变失败

本人拟在一段蛋白的第416定点突变，引物设计正确，PCR，转化正常，提取质粒也有，送测后，在目的区没有目的突变，而在非目的区发生了突变，请教原因！
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1楼 2013-09-04 11:42:04
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-09-06 11:58:10
这种情况我也碰到过, 应该是这一次PCR的时候效率不高, 但应该是有正确的, 楼主多送几个测序吧.
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2楼2013-09-04 21:26:55
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qiannv04

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-09-06 11:58:16
TAKARA有一个做点突变的试剂盒，我当时构突变体的时候就是用试剂盒做的，很方便，而且一次成功，你可以试试看
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3楼2013-09-04 21:42:19
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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你是什么方法做的定点突变，Overlap法，还是kpnI法？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-09-04 21:53:51
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
PCR后有跑过琼脂胶吗?发个胶图片看看
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
5楼2013-09-04 21:55:16
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bingdong05

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-09-04 21:53:51
你是什么方法做的定点突变，Overlap法，还是kpnI法？

over-lap方法的话，第三次pcr时如何做呢？退火温度如何设定呢？我最近在用该方法做定点突变，哎，困惑啊
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6楼2013-09-05 15:22:18
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-09-06 11:58:46
gyesang: 回帖置顶 2013-09-06 17:42:02
设计引物的时候试试这个软件，可以在突变附近通过同义突变增加一个酶切位点，这样可以很方便的挑菌落酶切鉴定是否突变成功。
http://www.psrg.org.uk/sdm-assist.html
参考文献
Karnik A, Karnik R and Grefen C: SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing "silent" restriction sites. BMC Bioinformatics 2013, 14:105; DOI: 10.1186/1471-2105-14-105
http://www.biomedcentral.com/1471-2105/14/105
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
7楼2013-09-06 00:14:19
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