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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白分离纯化

现在做分离纯化，用的离子交换层析，穿过液中没有我的目的蛋白，说明已经挂在柱子上了，但是洗脱的时候也看不到我的目的蛋白了，洗脱时是用的0-0.5M的NaCl，然后用2M NaCl洗，都没有我的目的蛋白，有谁知道这是什么原因啊。。。真的是快被这个分离纯化搞疯了了，哪位大侠懂啊，帮帮忙啊，谢谢啦
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1楼 2013-08-24 09:50:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-26 18:42:55
飘零的叶子: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-28 11:12:06
引用回帖:
9楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-24 16:44:44
怎么会铁中毒啊？！这个PH的控制应该是要根据蛋白的等电点来确定的，上阳离子柱的话，缓冲液的PH要低于蛋白的等电点，然后用高于蛋白等电点的PH来洗脱吧，是这个意思吧？！...

上样液含有自来水
或者上样液酸性而用铁棍搅拌都有可能引入铁离子。

具体的洗脱理论指导，我也不懂，做的还太少。而我这个其实没怎么关注过洗脱液的pH。
建议的那个不同pH测静态吸附率的方法还是很简单的；
另外有可能就是你的树脂已经不行了，你可以联系厂家看有没有专有的再生方法，或者就是你的树脂针对你的样品使用次数已经寿终正寝了。（或者你把型号讲一讲）。
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10楼2013-08-26 13:28:27
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FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 01:50:23
我的样品（小肽）0.05M就可以洗下来，有另外一个目标物（稍大的肽，吸附更牢）2M也可以洗下来。
个人认为你可以调下流动相pH，可能有效果。（NaCl溶液并不是理论的中性，而是酸性的）

你可以这样做：
做个静态吸附的，检测上清液，不断调pH检测。
不是很麻烦建议试试。
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2楼2013-08-24 10:35:43
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li1991511

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-25 01:50:33
你分离的是什么蛋白啊 要看蛋白的带点性质 我们一直在做生长激素 离子柱 先得用2MNacL 一个柱体积处理一下 激活 再用1M NaoH--1M NaCl 3个柱体积前处理 再用0.04M Nacl--10mM TE 平衡 后上样 用0.1MNacl 洗脱 中间要控制流速 要控制好洗脱液的电导率 还有很多
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这一年，异乡飘雪的日子。。。。。
4楼2013-08-24 12:35:16
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FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 01:50:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-24 11:29:48
我还是不太明白要怎么做，您能说的再具体点吗？！...

我个人是这么做的
1.先搅拌吸附上样，静置检测上清未吸附部分，
2.调节pH值，检测上清，这样可以研究最佳吸附条件。或者洗脱条件
如你个例，你也可以调节NaCl浓度，并辅以调节pH试试



我看了你下面的回复，有点相似。
我的柱子用的久了，收率降低了，而且损失的部分没有检测到。如你个例则是收率降为0了。
我已经确定是我的树脂柱效下降了，目前在尝试再生，结果还没出来。下周。应该可以有结果
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6楼2013-08-24 13:40:35
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FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-25 01:50:46
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-24 14:19:05
你也是用的阳离子交换树脂吗？！我又重生了，但是效果还是不好，就是找不到蛋白，你是怎么重生啊...

是的  我的产品等电点是酸性的。我洗脱倒是直接用的NaCl

我的产品在溶液状态上样，pH小于某特定值的情况下才能吸附，当pH大于它的时候吸附很差。
所以也可以指示用于洗脱。但是由于其本身自带缓冲，流动相酸碱度要控制好，不能破坏掉，又要有效果。仅供参考。

我用普通的酸碱再生法，再生柱子几乎是没有效果的。

我们的柱子可能是铁中毒之类的。
我们是向柱子厂家要的再生方法。（我们合作部门的一个老师搞到的）
参考一下后，又在网上搜索的铁中毒处理法，处理后效果待检。
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8楼2013-08-24 14:50:11
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-08-26 18:43:09
建议：
1. 电泳时加入上柱前的样品，确保目的蛋白是有表达的，或者更准确地讲，是存在于你上样前的样品里面的；
2. 层析时在2M NaCl后添加一步，使用0.5M NaOH再洗脱3个CV，然后取样电泳。

第1个建议不用说了，第2个主要是确定目的蛋白有没有沉淀在柱子上。
正常来说，柱子按一般流程再生就可以了。即使不再生，也不应出现目的蛋白消失的情况，除非是污染了蛋白酶。
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小兵一个
11楼2013-08-26 14:44:51
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-26 13:28:27
上样液含有自来水
或者上样液酸性而用铁棍搅拌都有可能引入铁离子。

具体的洗脱理论指导，我也不懂，做的还太少。而我这个其实没怎么关注过洗脱液的pH。
建议的那个不同pH测静态吸附率的方法还是很简单的；
...

恩，后来发现用1M NaOH洗下来了我的目的蛋白，看来是挂的太牢了，洗不下来，现在准备试一下用改变ph来洗脱了！你的柱子已经重生好了吗？！我的柱子是GE公司的SP Sepharose Fast Flow。
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12楼2013-08-28 11:09:56
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普通回帖

飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-24 10:35:43
我的样品（小肽）0.05M就可以洗下来，有另外一个目标物（稍大的肽，吸附更牢）2M也可以洗下来。
个人认为你可以调下流动相pH，可能有效果。（NaCl溶液并不是理论的中性，而是酸性的）

你可以这样做：
做个静态 ...

我还是不太明白要怎么做，您能说的再具体点吗？！
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3楼2013-08-24 11:29:48
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by li1991511 at 2013-08-24 12:35:16
你分离的是什么蛋白啊 要看蛋白的带点性质 我们一直在做生长激素 离子柱 先得用2MNacL 一个柱体积处理一下 激活 再用1M NaoH--1M NaCl 3个柱体积前处理 再用0.04M Nacl--10mM TE 平衡 后上样 用0.1MNacl 洗脱 中间要 ...

我的蛋白是碱性蛋白，等电点在8左右，用的是阳离子柱，之前就有在用这种方法做分离纯化，没问题，只是最近才出现这种情况，是不是柱材用的久了柱效低了呀
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5楼2013-08-24 12:40:23
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-24 13:40:35
我个人是这么做的
1.先搅拌吸附上样，静置检测上清未吸附部分，
2.调节pH值，检测上清，这样可以研究最佳吸附条件。或者洗脱条件
如你个例，你也可以调节NaCl浓度，并辅以调节pH试试



我看了你下面的回复 ...

你也是用的阳离子交换树脂吗？！我又重生了，但是效果还是不好，就是找不到蛋白，你是怎么重生啊
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7楼2013-08-24 14:19:05
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-24 14:50:11
是的  我的产品等电点是酸性的。我洗脱倒是直接用的NaCl

我的产品在溶液状态上样，pH小于某特定值的情况下才能吸附，当pH大于它的时候吸附很差。
所以也可以指示用于洗脱。但是由于其本身自带缓冲，流动相酸碱 ...

怎么会铁中毒啊？！这个PH的控制应该是要根据蛋白的等电点来确定的，上阳离子柱的话，缓冲液的PH要低于蛋白的等电点，然后用高于蛋白等电点的PH来洗脱吧，是这个意思吧？！
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9楼2013-08-24 16:44:44
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