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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白分离纯化
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白分离纯化

现在做分离纯化，用的离子交换层析，穿过液中没有我的目的蛋白，说明已经挂在柱子上了，但是洗脱的时候也看不到我的目的蛋白了，洗脱时是用的0-0.5M的NaCl，然后用2M NaCl洗，都没有我的目的蛋白，有谁知道这是什么原因啊。。。真的是快被这个分离纯化搞疯了了，哪位大侠懂啊，帮帮忙啊，谢谢啦
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1楼 2013-08-24 09:50:15
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-08-26 18:43:09
建议：
1. 电泳时加入上柱前的样品，确保目的蛋白是有表达的，或者更准确地讲，是存在于你上样前的样品里面的；
2. 层析时在2M NaCl后添加一步，使用0.5M NaOH再洗脱3个CV，然后取样电泳。

第1个建议不用说了，第2个主要是确定目的蛋白有没有沉淀在柱子上。
正常来说，柱子按一般流程再生就可以了。即使不再生，也不应出现目的蛋白消失的情况，除非是污染了蛋白酶。
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小兵一个
11楼2013-08-26 14:44:51
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FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 01:50:23
我的样品（小肽）0.05M就可以洗下来，有另外一个目标物（稍大的肽，吸附更牢）2M也可以洗下来。
个人认为你可以调下流动相pH，可能有效果。（NaCl溶液并不是理论的中性，而是酸性的）

你可以这样做：
做个静态吸附的，检测上清液，不断调pH检测。
不是很麻烦建议试试。
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2楼2013-08-24 10:35:43
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-24 10:35:43
我的样品（小肽）0.05M就可以洗下来，有另外一个目标物（稍大的肽，吸附更牢）2M也可以洗下来。
个人认为你可以调下流动相pH，可能有效果。（NaCl溶液并不是理论的中性，而是酸性的）

你可以这样做：
做个静态 ...

我还是不太明白要怎么做，您能说的再具体点吗？！
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3楼2013-08-24 11:29:48
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li1991511

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-25 01:50:33
你分离的是什么蛋白啊 要看蛋白的带点性质 我们一直在做生长激素 离子柱 先得用2MNacL 一个柱体积处理一下 激活 再用1M NaoH--1M NaCl 3个柱体积前处理 再用0.04M Nacl--10mM TE 平衡 后上样 用0.1MNacl 洗脱 中间要控制流速 要控制好洗脱液的电导率 还有很多
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这一年，异乡飘雪的日子。。。。。
4楼2013-08-24 12:35:16
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