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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-08-26 18:43:09
建议：
1. 电泳时加入上柱前的样品，确保目的蛋白是有表达的，或者更准确地讲，是存在于你上样前的样品里面的；
2. 层析时在2M NaCl后添加一步，使用0.5M NaOH再洗脱3个CV，然后取样电泳。

第1个建议不用说了，第2个主要是确定目的蛋白有没有沉淀在柱子上。
正常来说，柱子按一般流程再生就可以了。即使不再生，也不应出现目的蛋白消失的情况，除非是污染了蛋白酶。
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小兵一个
11楼2013-08-26 14:44:51
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-26 13:28:27
上样液含有自来水
或者上样液酸性而用铁棍搅拌都有可能引入铁离子。

具体的洗脱理论指导，我也不懂，做的还太少。而我这个其实没怎么关注过洗脱液的pH。
建议的那个不同pH测静态吸附率的方法还是很简单的；
...

恩，后来发现用1M NaOH洗下来了我的目的蛋白，看来是挂的太牢了，洗不下来，现在准备试一下用改变ph来洗脱了！你的柱子已经重生好了吗？！我的柱子是GE公司的SP Sepharose Fast Flow。
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12楼2013-08-28 11:09:56
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-08-26 14:44:51
建议：
1. 电泳时加入上柱前的样品，确保目的蛋白是有表达的，或者更准确地讲，是存在于你上样前的样品里面的；
2. 层析时在2M NaCl后添加一步，使用0.5M NaOH再洗脱3个CV，然后取样电泳。

第1个建议不用说了， ...

恩，用NaOH能洗下我的蛋白，洗脱的时候是不是可以增大NaCl的浓度来洗脱呢？！
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13楼2013-08-28 11:11:20
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不是，用NaOH才能洗脱下来，说明蛋白不稳定，或者层析方法不对，
可能是缓冲液、填料、复性方法的关系。
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小兵一个
14楼2013-08-28 11:31:49
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FTD顺

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2013-08-28 11:09:56
恩，后来发现用1M NaOH洗下来了我的目的蛋白，看来是挂的太牢了，洗不下来，现在准备试一下用改变ph来洗脱了！你的柱子已经重生好了吗？！我的柱子是GE公司的SP Sepharose Fast Flow。...

重生过了 ，对比实验待做。

你可以用碳酸钠试试，不一定要用氢氧化钠。
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15楼2013-08-28 14:12:12
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-08-28 11:31:49
不是，用NaOH才能洗脱下来，说明蛋白不稳定，或者层析方法不对，
可能是缓冲液、填料、复性方法的关系。

那应该要怎么改进呀？！
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16楼2013-08-28 16:21:59
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by FTD顺 at 2013-08-28 14:12:12
重生过了 ，对比实验待做。

你可以用碳酸钠试试，不一定要用氢氧化钠。...

碳酸钠洗下来得蛋白不会变性吗？还可以继续做后面的实验？
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17楼2013-08-28 16:22:54
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