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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » at克隆测序后只能查到一个引物序列
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zhoutianhe

铜虫 (小有名气)

[求助] at克隆测序后只能查到一个引物序列

小弟最近做克隆，测序过后只能查到一个引物序列。这是怎么回事呢？片段长约3000bp，blast过后有几个样显示和一个细菌序列十分相似（非目的片段），还有几个样根本无相似序列（如图，两端为载体）。求求给位大仙，大神，大侠们帮我分析一下原因，给点改进的方法。小弟要开学了，整个暑假都耗在这个上面了，真心想把做出来。
at克隆测序后只能查到一个引物序列
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1楼 2013-08-21 09:04:35
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
肯能是引物特异性不好，扩到细菌上面了~~
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总有一天我要修改用户名。
2楼2013-08-21 09:57:00
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zhoutianhe

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 137167741 at 2013-08-21 09:57:00
肯能是引物特异性不好，扩到细菌上面了~~

嗯，还有没有相似序列的是怎么回事呢？应该怎么改进呢？
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3楼2013-08-21 09:59:14
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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-08-27 12:44:48
首先保证引物序列的特异性，以及其它的重要特征，请查看有关引物设计的基础指导。或用软件设计。
其次摸索合适的PCR条件，最好得到单一的，大小合适的条带再纯化克隆。不要加多了模板，容易引入gDNA污染。
回收方式建议采用凝胶回收，保证去掉所有的模板等非目的DNA。
这些保证做好了，成功就会向你招手了。
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4楼2013-08-23 18:40:54
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

我也没有做出来，确实是引物特异性差。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2013-08-24 18:06:02
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zhoutianhe

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-08-24 18:06:02
我也没有做出来，确实是引物特异性差。

专家顾问也遇到了这样的问题？
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6楼2013-08-26 14:22:32
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhoutianhe at 2013-08-26 14:22:32
专家顾问也遇到了这样的问题？...

我不是什么都懂的
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2013-08-26 19:31:39
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