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SDS-PAGE胶的问题
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Sample Text 跑了几次，跑得慢，都得6-7小时，而且下面老有一堆跑不开，恳请大神指导？  2013.6.9032.JPG |
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凌波丽
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SDS电泳太慢和带弥散的改进措施 建议改进措施:1.可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为pH=8.9。2.可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100 V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150 V也能电泳成功。3.使用全新配置的缓冲溶液。4.适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker。5.保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。6.适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度。7. 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。8.样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液。9.分离胶的浓度应高于浓缩胶，但是胶浓度高会引起电泳时间变长，电泳时间会引起电泳带弥散。具体的参考的凝胶浓度参见附录。 10.控制好电泳时间，别把样品跑出了胶外。附录：1.样品处理（充分溶解样品）：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。2.在SDS-PAGE不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分离范围的关系：聚丙烯酰胺凝胶浓度/% 蛋白质分离范围/kd 5 36—200 7.5 24—200 10 14—200 12.5 14—100 15 14—60浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%。 2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。以上材料的主要参考文献是：吕宪禹 主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工业出版社，2010，第13章。 此文是近几日在论坛讨论SDS-PAGE时，我自己写的一篇总结，楼主可以参考。小木虫的帖子流动性太大，所以相关问题，我只能重复回答。 |
4楼2013-07-18 16:01:28
cicelyzh
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