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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——SDS-PAGE的问题
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qlw4567

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 求助——SDS-PAGE的问题

如图，我跑的胶好几次都是这样。。。。。上面从下到上分别是3个BSA，3个OVA，1个LYZ，1个分子量标记。可以我做的全是一片模糊。不明白为什么，我前几次也出现过这个现象。求大哥大姐们帮忙~~~
求助——SDS-PAGE的问题
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[ Last edited by 1949stone on 2013-7-19 at 08:10 ]
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努力和媳妇一起上完博士
1楼 2013-07-12 09:25:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

myprayer

专家顾问 (著名写手)

优秀版主

【答案】应助回帖

固定液 染色液 脱色液 三液是关键
脱色液 冰醋酸和乙醇（或者甲醇）80 250ml 然后用ddH2O定容到1000ml
放在摇床上的时候要轻摇然后期间更换脱色液2-3次
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12楼2013-07-21 12:05:07
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普通回帖

kx444555

至尊木虫 (正式写手)
确定脱色 完全了？？？
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星陈代谢
2楼2013-07-12 11:16:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-12 11:52:05
qlw4567: 金币+5, ★有帮助, 您这个回答，我在网上其他地方也看过，首先，缓冲溶液是按照网上的配方来的，pH都由pH计测试过。第二，我的样品溶解液配方为SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/Lph7.2磷酸缓冲液0.5mL，然后加水定容至10mL。再就是电极方向的问题，我电极安装应该没有问题，因为我也做出来过正常现象的凝胶。我的染色液是0.25g的考马斯亮蓝，454的50%的甲醇和46mL的冰乙酸。然后我一般泡30min左右。电泳时间一般跑到底要8个小时。但是我的板子很大，是20cm的板。 2013-07-12 15:40:33
提示五点：
1.缓冲溶液配好了吗？
在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
样品如何处理?

2.样品处理的怎么样？
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
（1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
（2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
（3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3.电极方向对了吗？

4.染色程序对不对？

5.电泳时间是不是长了？
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3楼2013-07-12 11:49:19
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qlw4567

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-07-12 11:16:58
确定脱色 完全了？？？

我从网上下的脱色液，脱色效果很差。不知道您的脱色液是用什么。我的是用75mL冰乙酸、875的水与50mL甲醇。我脱色12个小时还是不太好。
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努力和媳妇一起上完博士
4楼2013-07-12 15:31:12
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qlw4567

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-07-12 11:16:58
确定脱色 完全了？？？

另外我这个问题，从别的地方好像找到原因，只是可能，就是我的浓缩胶没做好，导致样品在侧面随机扩散，所以整个面上都是我的蛋白？我的浓缩胶的确做的不是很好，我做出来的浓缩胶一般都特别稀，甚至已经固化完了以后，我倾斜都还是像液体一样流动。我是不是该加一些引发剂和催化剂？（我开始加的引发剂和催化剂都比较少）
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5楼2013-07-12 15:47:33
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yangdayuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qlw4567 at 2013-07-12 15:31:12
我从网上下的脱色液，脱色效果很差。不知道您的脱色液是用什么。我的是用75mL冰乙酸、875的水与50mL甲醇。我脱色12个小时还是不太好。...

乙醇：乙酸：ddH2O=150:100:750,效果很好的。
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顺其自然，为所当为
6楼2013-07-12 16:04:14
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yangdayuan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qlw4567: 金币+10, ★有帮助, 兄弟，我的分离胶缓冲液好像有点问题，你看看(PH8.9)：1mol/L盐酸48mL,Tris36.3.用水定容100mL。可是这个明显不是1mol/L的。。。我还看了个配方是12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。再用双蒸水稀释至100ml，保存在4℃冰箱。用那个比较好？需不需要把离子强度弄到1mol/l? 2013-07-12 16:46:27
找不到原因的话，所有溶液重新配制
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顺其自然，为所当为
7楼2013-07-12 16:04:56
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qlw4567

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yangdayuan at 2013-07-12 16:04:14
乙醇：乙酸：ddH2O=150:100:750,效果很好的。...

这个是洗考马斯亮蓝的吗？
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努力和媳妇一起上完博士
8楼2013-07-12 16:47:09
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qlw4567

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangdayuan at 2013-07-12 16:04:56
找不到原因的话，所有溶液重新配制

另外，我配置蛋白质溶解液的时候，用的是SDS100mg,巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L的PH7.2的磷酸缓冲液0.5ml，然后加水定容。可是我看也有人用tris-HCL pH=8.0的缓冲液的。。。我不知道怎么选择？哥们儿您的是哪配方呢？
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努力和媳妇一起上完博士
9楼2013-07-12 17:07:20
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pangyu716

禁虫 (初入文坛)
★
qlw4567(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-21 12:02:31
本帖内容被屏蔽
10楼2013-07-18 17:02:18
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