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构建质粒的问题
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最近在构建一个质粒，化之后总是长不出菌来。很是苦恼 具体过程是：载体是一个Amp+的质粒，目的片段则含有kan+的抗性。目的片段用Taq plus酶P的，质粒经XcmI酶切后，和PCR片段一起跑电泳，然后割胶回收，回收的时候先PCR产物过柱，再酶切产物过柱，洗脱下来的产物取 再加入T4连接酶，4度过夜，第二天做转化。 之前转化都不长，昨天试了一下用单纯的质粒转化同一批次的感受态细胞，能长出一大片菌来，所以可以排除感受态和转化时操作有误的问题。问题应该出在连接上，求助各位，接下来应该怎么办？  酶切体系：dd水 27u 质粒8u buffer 4u XcmI酶 1u 用的是NEB的 37度 水浴2小时 跑胶的时候 20u PCR产物+4u 溴酚蓝 20u酶切产物+ 4u溴酚蓝（2个孔，共40u酶切产物） 连接体系：35u洗脱下来的回收产物，4u buffer 1u T4连接酶 [ 来自小组 生物医药家族 ] |
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摩尔比要怎么算啊……能指导一下吗？谢谢 
5楼2013-07-17 18:23:08
2楼2013-07-17 17:22:04
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