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履霜木虫 (正式写手)
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[求助]
免疫荧光染色，western blot均有目的蛋白，但是RT-PCR总是没有条带
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 如题了，大家帮忙想想了，这个蛋白是和脂肪代谢有关的，卵母细胞上面的。 |
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 核酸生物学实验经验 |
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矜天
木虫 (正式写手)
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2楼2013-07-17 18:09:46
凌波丽
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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履霜: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-18 08:12:18
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RT-PCR操作有问题吧。 在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有PCR产物的可能原因与对策： （1）RNA被降解（可能是主要的问题） 对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA； ②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 （2）RNA中包含逆转录抑制剂 对策：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录抑制剂包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA 同样品混合，同对照 对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA； ②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 （3）多糖同RNA共沉淀 对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录抑制剂包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA 同样品混合，同对照 RNA反应比较产量以检验抑制剂。 （3）多糖同RNA共沉淀 对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃ 保温10分钟。②对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或 随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 （5）起始RNA量不够 对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 （5）起始RNA量不够 对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 （6）RNA模板二级结构太多 对策：①将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退 火。②提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript 可以到 65℃。注意：不要在＞60℃时使用 oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反 应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV。③如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 （7）引物或模板对残余的RNA模板敏感 对策：在PCR前用RNaseH处理。 （8）靶序列在分析的组织中不表达 对策：尝试其他靶序列或组织 （9）PCR没有起作用 对策：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录产物。 |
3楼2013-07-17 23:19:21
【答案】应助回帖
★ ★ ★
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1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:52:33
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1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
如果是卵母细胞的话，那很好解释。当然前提是你的rtpcr实验结果是靠得住的 。MII期的卵母细胞中积累了许多母源性的mRNA和蛋白，为受精到合子基因激活（ZGA）这段时间支持胚胎的发育。因为这段时期受精卵中雌雄原核正在不断接近而重新形成2倍体，形成后还要经历表观遗传修饰的过程，所以合子基因组是不或极弱表达的，胚胎所有的活动都需要靠母源性mRNA翻译为蛋白以及已有蛋白去完成（现在发现好像还有小RNA什么的），mRNA的翻译、降解及蛋白的降解都是受到非常严格的调控的。 一般情况是可以检测到mRNA，但是却没有这种蛋白。楼主的情况比较少见，有蛋白而没有mRNA，说明这种蛋白对于卵母细胞是非常重要的，但是受精后（至少在ZGA之前）却并不需要或者不再多需要，所以没有它的mRNA储存。这是非常有趣的，好好做吧，也许可以出好文章。到时候要多给我金币昂  斑竹，这回可以给个EPI了吧？已经写了这么多，讲的这么详细了。非专业虫子也应该能看懂了。 |
4楼2013-07-17 23:41:58
履霜
木虫 (正式写手)
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5楼2013-07-18 08:14:16
6楼2013-07-18 08:46:44
