| 查看: 2070 | 回复: 5 | ||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
履霜木虫 (正式写手)
|
[求助]
免疫荧光染色，western blot均有目的蛋白，但是RT-PCR总是没有条带
|
|||
 如题了，大家帮忙想想了，这个蛋白是和脂肪代谢有关的，卵母细胞上面的。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有75人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- westernblot 目标蛋白无条带
已经有9人回复
- RT-PCR、western blot检测所需细胞数及细胞培养板的选择
已经有7人回复
- 如何做 Western blot 以及RT-PCR 的加药处理时间梯度？细胞数量如何统一？
已经有9人回复
- RT-PCR时GAPDH条带不一样，目的条带呈涂抹的模糊带如何改进~~
已经有7人回复
- 14kd的蛋白，做westernblot，电转条件是怎样的
已经有11人回复
- RT-PCR的cDNA不能扩增出目的条带，只有内参基因能扩增出来
已经有14人回复
- RT-PCR没有出现内参基因的条带和目的条带，请问是什么原因？
已经有11人回复
- 有没有人用Western blot在做17kDa蛋白质,求经验！！！
已经有22人回复
- rna终于提取出来了，可是反转录pcr（rt pcr）没有条带
已经有19人回复
- RT-PCR时GAPDH能跑出来，但目的条带跑不出来~~
已经有7人回复
- RT-PCR跑出来的条带没有量效关系怎么办？什么原因
已经有3人回复
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？
已经有9人回复
6楼2013-07-18 08:46:44
矜天
木虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 10054.1
- 散金: 1114
- 红花: 2
- 帖子: 816
- 在线: 102.2小时
- 虫号: 1228488
- 注册: 2011-03-10
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2013-07-17 18:09:46
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 00:45:31
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:51:49
履霜: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-18 08:12:18
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 00:45:31
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:51:49
履霜: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-18 08:12:18
|
RT-PCR操作有问题吧。 在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有PCR产物的可能原因与对策： （1）RNA被降解（可能是主要的问题） 对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA； ②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 （2）RNA中包含逆转录抑制剂 对策：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录抑制剂包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA 同样品混合，同对照 对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA； ②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 （3）多糖同RNA共沉淀 对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录抑制剂包括：SDS， EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA 同样品混合，同对照 RNA反应比较产量以检验抑制剂。 （3）多糖同RNA共沉淀 对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 （4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃ 保温10分钟。②对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或 随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 （5）起始RNA量不够 对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 随机六聚体。③确定GSP是反义序列。 （5）起始RNA量不够 对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 （6）RNA模板二级结构太多 对策：①将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退 火。②提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript 可以到 65℃。注意：不要在＞60℃时使用 oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反 应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV。③如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 （7）引物或模板对残余的RNA模板敏感 对策：在PCR前用RNaseH处理。 （8）靶序列在分析的组织中不表达 对策：尝试其他靶序列或组织 （9）PCR没有起作用 对策：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录产物。 |
3楼2013-07-17 23:19:21
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 学习下 2013-07-18 07:52:33
履霜: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-07-18 08:12:26
如果是卵母细胞的话，那很好解释。当然前提是你的rtpcr实验结果是靠得住的 。MII期的卵母细胞中积累了许多母源性的mRNA和蛋白，为受精到合子基因激活（ZGA）这段时间支持胚胎的发育。因为这段时期受精卵中雌雄原核正在不断接近而重新形成2倍体，形成后还要经历表观遗传修饰的过程，所以合子基因组是不或极弱表达的，胚胎所有的活动都需要靠母源性mRNA翻译为蛋白以及已有蛋白去完成（现在发现好像还有小RNA什么的），mRNA的翻译、降解及蛋白的降解都是受到非常严格的调控的。 一般情况是可以检测到mRNA，但是却没有这种蛋白。楼主的情况比较少见，有蛋白而没有mRNA，说明这种蛋白对于卵母细胞是非常重要的，但是受精后（至少在ZGA之前）却并不需要或者不再多需要，所以没有它的mRNA储存。这是非常有趣的，好好做吧，也许可以出好文章。到时候要多给我金币昂  斑竹，这回可以给个EPI了吧？已经写了这么多，讲的这么详细了。非专业虫子也应该能看懂了。 |
4楼2013-07-17 23:41:58
